[發明專利]一種三層結構的肌酸酐含量檢測試劑的制備方法

有效

• 申請號: 201310363461.0
• 申請日: 2011-09-20
• 公開（公告）號: CN103472239A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 徐維琛;朱進清;高玉蘭;程志敬
• 申請（專利權）人: 天津希恩思生化科技有限公司
• 主分類號: G01N33/70
• 分類號: G01N33/70;G01N21/64
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

本申請是一種肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法的分案申請，原申請申請日2011年9月20日，原申請號：2011102799693，發明創造名稱：一種肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法。

技術領域

本發明屬于肌酸酐檢測領域，尤其是一種肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法。

背景技術

肌酸酐是磷酸肌酸代謝的產物，其化學結構是肌酸通過脫水縮合形成的內酰胺。肌酸酐一般存在于血液中，通過血液循環到達腎臟并被過濾掉。對于腎功能正常的人群來說，血液中的肌酸酐濃度因人因地而異。一般而言，在無大體力負擔的情況下，女性的血液中的肌酸酐濃度在45-60μM；男性的血液肌酸酐濃度在60-110μM的范圍內浮動。當腎功能出現問題時，腎臟過濾清除肌酸酐的能力就會降低，導致血液中肌酸酐的濃度異常升高而尿液中肌酸酐濃度降低，因此通過測量血液和尿液中肌酸酐的濃度，就可以測量肌酸酐清除率甚至腎小球率過濾，這兩個參數對于衡量腎功能具有重要的意義，因此，可以快捷的測量血液和尿液中的肌酸酐濃度，對于臨床和科研，都具有十分重大的應用前景。

肌酸酐的測量比較困難。目前常用的方法是質譜法（同位素稀釋質譜法）、高效液相色譜法、液相色譜-質譜連用法以及抗體檢測（ELISA），這些方法一般都需要昂貴的儀器，如質譜儀、液相色譜儀或酶標儀等，以及受過系統訓練的分析化學操作人員的操作，極大地提高肌酸酐測量的經濟成本和時間成本，以及肌酸酐測量在邊遠地區的應用。

質譜法通過在樣品中人為加入含有某種同位素（如O-18）的肌酸酐并對此樣品進行質譜分析。比對質譜結果中O-18的豐度和O-18在自然界中的豐度即可計算出肌酸酐的濃度。人為加入的肌酸酐可以嚴格控制，作為一種內標準（internal?calibration），這種方法可以有效的降低誤差。根據最新研究，用質譜法得到的肌酸酐濃度偏低，這將在臨床上引起一系列問題，美國FDA也開始考慮新的肌酸酐檢測手段。

液相色譜法是在質譜的基礎上使用高效液相色譜對樣品進行純化并用質譜進行檢測。質譜法和液相色譜法無法自動化、操作復雜，并且需要分析團隊對儀器進行操作和維護，而ELISA法需要使用價格昂貴的酶標儀，雖然其靈敏度極高，但是選擇性較差，經常會高估肌酸酐的濃度，導致臨床用藥的過量或不足。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種選擇性高、靈敏度高和使用方便的肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種肌酸酐含量檢測試劑，包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，熒光染料5（6）-羧基-2,7-二氯二氫熒光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成為肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸隨之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的過氧化氫，在辣根氧化物酶的催化下，過氧化氫催化氧化了5（6）-羧基-2,7-二氯二氫熒光素二特戊酸酯并生成具有熒光響應的產物，通過監測熒光增強的速率以及標準曲線，獲得肌酸酐濃度，其中所述肌酸酐酶：肌酸酶：肌氨酸氧化酶：辣根過氧化物酶：熒光染料的重量比為：1：50：60：5。

而且，包括如下三層結構：

⑴染料底層：將熒光染料修飾過的纖維素和D4水凝膠混合并攪拌，在一張干凈的塑料薄膜上用刮刀涂膜機涂上一層D4水凝膠的薄膜并使之自然風干；

⑵蛋白酶固定層：在PVA-Sbq（聚丙烯醇-苯基吡啶乙烯絡合物）的水溶液中加入10%的牛血清蛋白以及反應所需的肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，攪拌25-40分鐘以上，用刮刀涂膜機涂上一層酶的PVA-Sbq溶液，將紫外燈置于膜層的上方30分鐘，使苯基吡啶乙烯交聯并使膜層變干；

⑶頂層保護層：最后在上面用刮刀涂膜機涂上一層含有10%炭黑的D6水凝膠，并使膜層自然風干。

而且，三層結構的具體制備步驟如下：

⑴將176mg纖維素固定的5（6）-羧基-2,7-二氯二氫熒光素二特戊酸酯和2.6g的4%D4水凝膠溶液混合并攪拌均勻，使纖維素粉末在溶液中均勻分散；

⑵將步驟⑴中所制備的溶液均勻在塑料薄膜上使之形成一層厚度為100uM的薄膜并晾干；

⑶將30mg肌酸酶、35mg辣根過氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g濃度為10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上攪拌均勻；