[發明專利]一種腸道病毒71型可視化重組病毒及其應用

在審

• 申請號: 201310363321.3
• 申請日: 2013-08-20
• 公開（公告）號: CN104419712A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 秦成峰;曹瑞源;秦鄂德;韓劍峰;李曉峰
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: C12N15/41
• 分類號: C12N15/41;C12N7/01;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12Q1/70;G01N33/577;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種腸道病毒71型可視化重組病毒及其應用，特別涉及一種腸道病毒71型3C蛋白可視化重組病毒及其應用。

背景技術

腸道病毒71型（EV71）是小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus）的重要成員。EV71感染主要引起手足口病（Hand-Foot-Mouse?Disease），可導致嚴重的神經系統綜合癥，是手足口病重癥和死亡病例的主要原因。目前臨床上尚無針對EV71的有效疫苗和特異抗病毒藥物。

EV71的基因組為單股正鏈RNA分子，包含一個單一讀碼框，編碼4個結構蛋白（VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白和VP4蛋白）和7個非結構蛋白（2A蛋白、2B蛋白、2C蛋白、3A蛋白、3B蛋白、3C蛋白和3D蛋白）。EV71病毒基因組的5′和3′端為非編碼區（untranslated?region，UTR），5′UTR內含有內部核糖體進入位點（IRES）等復制翻譯調控元件，3′UTR內含有三個莖環結構和PolyA元件。3C蛋白，又稱3C蛋白酶（3C^pro），是病毒基因組編碼的兩個蛋白酶之一，主要負責除VP1-2A、VP2-VP4位點以外，病毒多聚蛋白其它位點的切割。此外，3C^pro還可對部分宿主蛋白進行切割，是病毒-宿主相互作用過程中的關鍵蛋白，但目前對于3C^pro在宿主細胞內的表達與轉運機制，及其與宿主因子相互作用的機制尚不清楚。

報告病毒是將熒光蛋白標簽插入病毒基因組中得到的重組病毒，能夠實現病毒基因組翻譯表達水平的監測，以及病毒蛋白的示蹤。目前對蛋白進行熒光標記最常用的手段是傳統的免疫熒光技術，但是該技術無法對病毒進行實時成像。EV71病毒基因組總長只有7.4kb，3C^pro基因長度約500bp，將長度約為1kb的GFP、RFP或其它熒光素酶的編碼基因插入病毒基因組具有較大難度，因此目前EV71的可視化報告病毒尚未見報道。

最近的研究報道了一種新的成像技術即“雙砷-四半胱氨酸（biarsenical?tetracysteine，TC）技術。該技術利用蛋白質中CCPGCC結構域作為標簽，當一種可以穿透脂雙膜的雙砷染料共價結合上述結構域上的兩對半胱氨酸時，便可實現對TC標簽蛋白質的熒光成像。相對傳統的蛋白熒光標記技術，該技術具有以下優點：（1）CCPGCC標簽只含有6個氨基酸，對目標蛋白結構破壞甚為微小，因此可極大的提高獲得突變病毒的成功率；（2）具有TC標簽的蛋白一旦翻譯產生，雙砷染料即刻能夠結合到蛋白實現成像，相比其它需要折疊后才能夠實現熒光成像的蛋白，其成像的速度快，在進行蛋白表達及轉運的相關研究時，能夠更加真實的反應靶蛋白本身的實際情況；（3）該染料能夠自由穿透核膜和質膜，在胞內成像無死角。

發明內容

本發明的目的是提供一種腸道病毒71型可視化重組病毒及其應用。

本發明首先保護一種雙鏈DNA分子，為將CCPGCC標簽的編碼基因插入腸道病毒71型的基因組DNA的3C蛋白酶編碼區中得到的DNA分子；所述CCPGCC標簽為序列表的序列1所示的多肽片段。

所述CCPGCC標簽的編碼基因可如序列表的序列2所示。

所述3C蛋白酶可如序列表的序列5所示。

所述3C蛋白酶編碼區可如序列表的序列3所示自5’末端第5387至5935位核苷酸所示。

所述腸道病毒71型具體可為AH/08/06株。

所述AH/08/06株的基因組DNA如序列表的序列3所示。

所述雙鏈DNA分子具體可如序列表的序列4所示。

含有以上任一所述雙鏈DNA分子的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。

所述重組載體具體可為重組質粒乙；所述重組質粒乙與重組質粒甲的差異僅在于在序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子第5929位核苷酸和第5930位核苷酸之間插入了編碼CCPGCC標簽的核苷酸序列“tgctgcccaggatgctgc”；所述重組質粒甲具體可為將序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子插入pBR322質粒的多克隆位點（如SnaBI和MluI酶切位點之間）得到的重組質粒。

本發明還保護一種腸道病毒71型的重組病毒，其基因組RNA的編碼DNA如序列表的序列4所示。