[發明專利]一種采用低滲透壓收獲液收獲病毒的方法

有效

• 申請號: 201310363119.0
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103602639A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 黃金鳳;張嵬;于巍;孟凡紅;何玉君;谷業新;高強;尹衛東
• 申請（專利權）人: 科興（大連）疫苗技術有限公司
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;A61K39/25;A61K39/15;A61K39/125;A61K39/29;A61P31/14;A61P31/22;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種采用低滲透壓收獲液裂解細胞使病毒釋放并使其得到有效收獲的工藝方法。

背景技術

水痘-帶狀皰疹病毒（Varicella-Zoster?virus，VZV）屬α皰疹病毒亞科，為雙鏈DNA病毒，其原發感染為水痘，潛伏感染再激活時可引發帶狀皰疹。接種疫苗是預防由VZV引起的水痘與帶狀皰疹的最有效措施。迄今為止，水痘減毒活疫苗（Oka株）是唯一獲準用于預防由VZV引起的疾病的疫苗。接種疫苗是公認的預防由VZV引起的水痘的最有效措施。

輪狀病毒(Rotavirus，RV)是引起嬰幼兒嚴重腹瀉和脫水的主要病因，在發展中國家和發達國家都是一個重要的公共衛生問題，全世界<5歲的兒童每年大約有600,000左右的死亡病例，85%的死亡兒童在發展中國家。輪狀病毒腹瀉不但造成社會的疾病負擔，而且帶來了巨大的經濟損失。疫苗免疫是唯一可行的預防輪狀病毒腹瀉較高發病率和死亡率的方法。有鑒于此，世界衛生組織在1997年將輪狀病毒疫苗的開發列為全球新疫苗研制開發的第一項目，世界各國的有關機構都在積極進行輪狀病毒疫苗的研制工作。

EV71病毒和CA16病毒均為引起嬰幼兒手足口病的主要病原體。人腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科,基因組為單股正鏈RNA,長度約為7400個核苷酸,僅含有一個開放讀碼框,編碼的多聚蛋白約含2190個氨基酸。該病毒最早于1969～1970年間在美國加利福尼亞州發生中樞神經系統癥狀的嬰兒糞便中分離得到。電鏡觀察發現該病毒的形態及理化特性都與當時已知的其他腸道病毒類似,但中和抗體試驗和免疫擴散試驗卻未發現交互作用,因此認為是一種新型腸道病毒,命名為人腸道病毒71型。

柯薩奇病毒A組16型（簡稱：CA16）于1958年被分離出，CA16是單正鏈RNA病毒，病毒顆粒呈球形，為二十面體立體對稱，無包膜。基因組長約7?400bp,包括5′及3′端的非編碼區和中間一個大的開放讀碼框(ORF),依次由VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D?11個基因組成,主要編碼產生病毒結構蛋白。在歷次手足口病的流行中,EV71與CA16交替或共同出現,成為HFMD的主要病原體。

甲型病毒性肝炎簡稱甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒(甲肝病毒)引起的一種急性傳染病，糞-口傳播是其主要傳播途徑。甲型肝炎病毒屬于微小核糖核酸病毒科，肝病毒屬。病毒顆粒呈球形，直徑約為27nm，無囊膜，衣殼由32個殼粒組成，呈20面體立體對稱，每個殼粒具有四個多肽分別為病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，基因組為單股正鏈RNA，其長度相當于7500個核苷酸左右。在RNA的3′末端有多聚的腺苷序列，在5′末端以共價形式與病毒基因組蛋白。根據病毒核苷酸序列分析，人甲肝病毒可以分為四個基因型，但其抗原性相似，所以甲型肝炎病毒只有一個血清型。

病毒疫苗的制備一般是先將毒種接種于未感染的適宜代次的細胞上進行傳代，當達到一定程度細胞病變時收獲感染細胞，加適量疫苗液制成原液。原液經凍融，超聲破碎，離心，過濾澄清，得到上清液，加入疫苗穩定劑即半成品；半成品凍干或直接分裝后即成為凍干疫苗或液體劑型疫苗。

自1974年Oka株水痘減毒活疫苗問世以來，歐美等國家陸續開始了水痘疫苗的生產，其生產工藝均采用克氏瓶靜止培養，生產規模和病毒產量受到一定的限制。輪狀病毒的大規模培養主要采用轉瓶或細胞工廠，EV71、CA16病毒和甲肝病毒的大規模培養主要采用細胞工廠，上述病毒均屬于胞內病毒，在病毒的收獲工藝中需要有效的破碎裂解細胞使病毒釋放，并保證病毒顆粒的完整性。而不同的收獲工藝對細胞的裂解程度和病毒顆粒的完整性的影響不同。收獲方式直接影響病毒滴度值，而病毒收獲液的有效高滴度值是影響疫苗品質的重要因素。因此，選擇一種合適、有效的病毒收獲方式至關重要。

水痘病毒、輪狀病毒、EV71病毒、CA16病毒和甲肝病毒均屬于細胞內病毒，具有很強的細胞結合活性，病毒收獲時必須收集并破碎細胞才能得到游離的病毒顆粒。目前針對上述病毒的上市產品中，各廠家多采用凍融法收集和破碎細胞，該方法適合于轉瓶和克式瓶等培養方式，但不適用于細胞工廠培養系統；也有廠家采用含EDTA或胰蛋白酶的消化液經消化收集細胞，并采用凍融法破碎細胞，該方法適用于細胞工廠培養系統，但存在引入消化液成份并難以去除的弊端，對疫苗的安全性存在風險。