[發明專利]大熊貓白細胞介素7基因IL-7免疫佐劑的構建方法

無效

• 申請號: 201310362836.1
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103589746A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 李德生;朱玲;張和民;王承東;古鋒;劉驍
• 申請（專利權）人: 四川臥龍國家級自然保護區管理局;四川農業大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;A61K39/39;A61K39/12;A61P31/14
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技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及的是一種大熊貓白細胞介素7(IL-7)基因IL-7免疫佐劑的構建方法。?

背景技術

IL-7又名前B細胞生長因子、淋巴細胞生成素，是骨髓基質細胞和胸腺基質細胞產生的細胞因子，能促進淋巴細胞早期增值和分化和誘導巨噬細胞增值。在動物的脾臟、胸腺、骨髓和腎臟中都能檢測到IL-7。?

IL-7是B細胞生長和極早期B細胞生存、分化、增殖因子。IL-7也能在某些因素(如：輻射或免疫抑制劑)所致的應激加快B細胞的恢復。IL-7能誘導不成熟的T細胞增殖和分化，誘導胸腺細胞中CD4⁺、CD8⁺、CD3⁺、CD2⁺、SCA-1⁺的細胞優勢擴增。IL-7也能引起外周CD4⁺或CD8⁺T細胞增殖，其中CD45RO⁺的記憶T細胞增殖更明顯。IL-7還能誘導外周T細胞分泌IL-2，表達IL-2受體(IL-2R)和轉鐵蛋白受體，促進細胞分泌白細胞介素(LI-4)和粒細胞-巨噬細胞克隆刺激因子(GM-CSF)。?

IL-7不僅對T、B淋巴細胞內環境的穩定性起重要作用，同時也對其他細胞譜系(如抗原遞呈細胞)的生存和分化起重要作用。LI-7還對巨噬細胞起作用，作用包括：直接誘導巨噬細胞表達IL-18和巨噬細胞炎癥蛋白1β；誘導巨噬細胞產生IL-6、IL-1α、IL-1β和TNF-α；增強單核細胞在體外溶解靶細胞的能力。?

IL-7的生物學活性決定了它的很多用途。IL-7可作為疫苗免疫佐劑，促進B細胞生長和分化，誘導不成熟的T細胞增殖和分化，增強疫苗對機體的刺激效應，提高保護力。IL-7還可作為免疫調節劑，誘導TNF-α及TNF-β分泌，抑制IL-4及IL-10合成，從而調節Th1/Th2平衡。?

IL-7在抗腫瘤免疫治療有潛在的價值。目前雖未見體外直接應用IL-7抑制腫瘤細胞增殖的報道，但IL-7體內應用則有一定的抗腫瘤活性。還有研究證明中國HIV/AIDS患者IL-7水平的升高，加速了艾滋病疾病進展，血漿IL-7含量可作為判斷HIV疾病進展的一個標志。?

隨著基因克隆技術和生物信息學軟件使用的成熟和完善，基因克隆不再是難題。通過IL-7基因的克隆及高效表達，得到大量純化重組IL-7已經很容易成為現實，這將一步推動對IL-7生物活性的研究。目前對淋巴細胞生成的最初階段尚知之甚少，可以通過對多種動物IL-7基因進行克隆和比較分析，加深對其的認識。細胞因子作為一種新型的免疫佐劑，將會為動物疾病的免疫預防和免疫治療提供廣闊的應用前景。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種大熊貓白細胞介素7基因IL-7免疫佐劑的構建方法。?

本發明的技術方案如下：?

一種大熊貓白細胞介素7基因IL-7免疫佐劑的構建方法，包括以下步驟：?

A1?IL-7基因的PCR克隆?

A11?IL-7基因的引物設計及合成?

根據NCBI上公布的預測的熊貓IL-7基因序列，通過在線信號肽預測軟件找出分析出其信號肽，設計一對引物，擴增成熟的IL-7基因；?

11：GAATTCACCATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAGACG；?

I2：GTCGACTTAATGCTCTTTAGAGCCCCTC；?

A12?大熊貓外周血淋巴細胞RNA的提取；?

A121?外周血淋巴細胞的分離和培養；?

通過下列方法進行刺激培養，增加細胞因子的轉錄翻譯：?

(1)采大熊貓靜脈血2ml加入肝素抗凝管；?

(2)輕輕搖動抗凝管，使血液與抗凝劑混勻，5min后加入2ml?Hank’s液，手動?輕輕搖勻；?

(3)用毛細吸管吸取稀釋后的抗凝血，全部沿管壁緩慢加至另一含4ml淋巴細胞分離液的試管液面上，注意保持兩種液體界面清晰；?

(4)將試管平衡后置水平式離心機，4℃，2000rpm離心10min；?

(5)用毛細吸管仔細吸取血漿與分離液界面處淋巴細胞層至一刻度離心管內；?

(6)加入Hank’s液5ml，手動旋轉試管使液體混勻，2000rpm離心10min，棄上清；?