[發明專利]大熊貓白細胞介素7基因IL-7免疫佐劑的構建方法

無效

• 申請號: 201310362836.1
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103589746A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 李德生;朱玲;張和民;王承東;古鋒;劉驍
• 申請（專利權）人: 四川臥龍國家級自然保護區管理局;四川農業大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;A61K39/39;A61K39/12;A61P31/14
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1.一種大熊貓白細胞介素7基因IL-7免疫佐劑的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

A1?IL-7基因的PCR克隆

A11?IL-7基因的引物設計及合成

根據NCBI上公布的預測的熊貓IL-7基因序列，通過在線信號肽預測軟件找出分析出其信號肽，設計一對引物，擴增成熟的IL-7基因；

I1：GAATTCACCATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAGACG；

I2：GTCGACTTAATGCTCTTTAGAGCCCCTC；

A12?大熊貓外周血淋巴細胞RNA的提取；

A121?外周血淋巴細胞的分離和培養；

通過下列方法進行刺激培養，增加細胞因子的轉錄翻譯：

(1)采大熊貓靜脈血2ml加入肝素抗凝管；

(2)輕輕搖動抗凝管，使血液與抗凝劑混勻，5min后加入2m1Hank’s液，手動輕輕搖勻；

(3)用毛細吸管吸取稀釋后的抗凝血，全部沿管壁緩慢加至另一含4ml淋巴細胞分離液的試管液面上，注意保持兩種液體界面清晰；

(4)將試管平衡后置水平式離心機，4℃，2000rpm離心10min；

(5)用毛細吸管仔細吸取血漿與分離液界面處淋巴細胞層至一刻度離心管內；

(6)加入Hank’s液5ml，手動旋轉試管使液體混勻，2000rpm離心10min，棄上清；

(7)用5ml?Hank’s重懸，2000rpm離心10min，棄上清；

(8)用5ml含10％血清的1640營養液重懸淋巴細胞后轉移至細胞瓶中，置37℃C0₂培養箱培養，半小時后加入刀豆蛋白conA，使其終濃度為7ug/ml；

(9)置37℃CO₂培養箱懸浮培養72小時；

A122?RNA的提取；

A13?IL-7基因的擴增；

A2?pMD-IL-7質粒的構建；

A21?連接和轉化；

取pMD19-T載體和回收的IL-7的cDNA，于16℃連接過夜，然后將連接產物轉化到DH5α；

A22?pMD-IL-7重組質粒的鑒定；

將酶切鑒定為陽性的重組質粒送寶生物工程(大連)有限公司進行測列，將測序正確的質粒命名為pMD-IL-7；

A3?pCI-IL-7真核表達質粒的構建；

A31?IL-7基因的酶切回收；

用EcoR?I和Sal?I對pMD-IL-7進行雙酶切；酶切產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收目的基因；

A32?pCI-neo載體的酶切回收

用EcoR?I和Sal?I對pCI-neo進行雙酶切；酶切產物通過1％瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收5400bp左右的載體基因；

A33?連接與轉化

取酶切回收的pCI-neo載體片段和酶切回收的IL-7目的基因，于16℃連接過夜，然后通過熱激法轉化到DH5α；

A34?重組質粒的鑒定

將轉化好的菌擴大培養后，小量提取質粒，用EcoR?I和Sal?I對重組質粒進行雙酶切鑒定；用1％的瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下觀察電泳圖；將酶切鑒定為陽性的重組質粒送寶生物工程(大連)有限公司測序，將測序正確的質粒命名為pCI-IL-7。