[發明專利]重組大熊貓IL-6免疫佐劑的制備方法

無效

• 申請號: 201310362610.1
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103409453A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 李德生;朱玲;張和民;王承東;易悅;劉驍
• 申請（專利權）人: 四川臥龍國家級自然保護區管理局;四川農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;A61K39/175;A61K39/39;A61P31/14
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技術領域

本發明涉及，尤其涉及的是一種重組大熊貓IL-6(gpIL-6)免疫佐劑的制備方法。?

背景技術

大熊貓被譽為中國的“國寶”，是世界級珍稀野生動物，然而它卻瀕臨滅絕，除了人為原因對大熊貓棲息地的破壞以外，疾病死亡成為當前大熊貓種群瀕危的關鍵原因之一。在大熊貓所患的40多種疾病中，犬瘟熱IL-6是威脅大熊貓種群數量和生命安全的首要烈性傳染病。疫苗免疫目前是預防控制CDV的主要措施，但當前使用的疫苗并不十分理想，存在免疫效率低與安全性差兩大難題。因此，在安全劑量疫苗接種下提高大熊貓機體的免疫力，成為當今疫苗開發研究的焦點。細胞因子是由免疫效應細胞和其他相關細胞產生，具有多種生物學活性。在免疫應答的產生和調節中具有重要作用。?

對于IL-6(白細胞介素6)的研究，最早可追溯到1980年，Weissenbach?J等人發現成纖維細胞經Poly?I-C刺激后能產生一種抑制病毒復制的細胞因子，當時稱其為干擾素β2(Inteferonβ2，IFNβ2)。后經實驗證實，干擾素β2與隨后克隆得到的一系列生長因子，如B細胞分化因子(BCDF-2)，細胞毒T細胞分化因子(CDF)，肝細胞刺激因子(HSF)等，均是分子量為21～30kD的同種蛋白，因此為了避免名稱使用的混亂，統一稱之IL-6。IL-6是迄今發現的功能最為廣泛的細胞因子之一。?

IL-6的來源十分廣泛，機體的許多淋巴和非淋巴細胞均可表達IL-6，如T細胞、B細胞、單核-巨噬細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、上皮細胞、造血干細胞等，其中以巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞為主。其中血液IL-6主要來源于活化的單核細胞，局部組織IL-6由成纖維細胞與局部巨噬細胞產生，T細胞、B細胞、骨髓基質細胞等都能在不同條件下產生IL-6。另外，細胞因子(IL-1、IL-2)、促分裂原(LPS、PHA)、微生?物(某些細菌、病毒)和防線菌酮均能刺激或增加IL-6產生。?

人和小鼠的IL-6基因分別定位于染色體7p15-21和517.0cM，都有5個外顯子和4個內含子。人IL-6前體為212個氨基酸殘基，包括一段含28個氨基酸殘基的信號肽，在分泌到胞外時信號肽被切割。成熟的IL-6含184個氨基酸殘基，其1-28位氨基酸殘基區無重要功能，主要跟蛋白的正確折疊有關；97-104位氨基酸殘基區主要作用是維持蛋白結構完整；29-34位氨基酸殘基區與180-184位氨基酸殘基區緊密靠近，構成hIL-6的活性位點，在與受體結合、發揮生物功能過程中起關鍵作用。轉錄后修飾包括N糖基化、O糖基化和磷酸化，位于45aa，51aa，74aa，84aa的4個半胱氨酸形成兩對二硫鍵，這對維持hIL-6的構象至關重要，N端28個氨基酸殘基雖不直接與IL-6生物學活性有關，但對整個IL-6分子的組成起穩定作用。同時，研究表明，IL-6翻譯后能被糖基化修飾或絲氨酸磷酸化，在原核表達中磷酸化與否不影響其生物學活性。對hlL-6的二級結構進行預測，發現IL-6由4個反向平行排列的α螺旋，2個長的和1個短的襻結構組成。X射線晶體衍射技術研究表明，IL-6和粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)具有共同的結構特征，并且在氨基酸序列上有高度的同源性。IL-6是一種糖蛋白，分子量由于在不同組織與個體間蛋白糖基化，磷酸化差異很大在19-28KDa之間。?

IL-6受體(IL-6R)分布細胞表面，并且分布數量有一些差別，從幾百到上萬個不等。IL-6受體在整個IL-6信號傳導過程中起到重要的作用，IL-6只有與細胞膜上的受體結合后才能催發一系列級聯反應，最終產生生物學效應。?

IL-6R為異源二聚體，由80KD的α鏈和130KD的β鏈(gp130)組成，α鏈cDNA全長約5.0kb，cDNA編碼的蛋白為468個氨基酸，其中含有19個氨基酸殘基的疏水信號肽，成熟的IL-6Rα鏈由以下三部分組成：339個氨基酸組成的胞外區，28個氨基酸組成的跨膜區和胞漿內82個氨基酸組成的功能區，胞膜外區含一個Ig樣區(C2，約100個氨基酸)、2個III型纖維結合蛋白結構(各含100個氨基酸)及1個細胞因子受體的同源區所組成，后者含4個保守的Cys和一個WSXWS結構。gp130只有在糖基化后才能由胞漿內移到細胞表面，成為成熟的gp130，從而發揮生物學功能。成熟的gp130由三部分組成：597個氨基酸殘基組成的膜外區、22氨基酸殘基組成的跨膜區和277個氨基酸殘基?組成的胞漿區。?