[發明專利]重組大熊貓IL-6免疫佐劑的制備方法

無效

• 申請號: 201310362610.1
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103409453A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 李德生;朱玲;張和民;王承東;易悅;劉驍
• 申請（專利權）人: 四川臥龍國家級自然保護區管理局;四川農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;A61K39/175;A61K39/39;A61P31/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種重組大熊貓IL-6免疫佐劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟

A1大熊貓IL-6全基因克隆；

A11大熊貓外周血淋巴細胞體外培養；

無菌條件下采取健康大熊貓抗凝血2ml，置于EDTA-Na₂真空管中，然后往里加入等量D-Hanks液稀釋；緩慢加入4ml淋巴細胞分離液于稀釋后的大熊貓外周血中，2000r／min離心20min。小心將白細胞移于另一試管，加等量RPMI1640液，2000r／min離心15min，去上清，沉淀物再加入4mlRPM11640液，洗滌2次，去上清；沉淀淋巴細胞用含10μg／mL?ConA、10％小牛血清、100μg／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素的RPMI1640液懸浮，取10μL細胞懸液計數，將細胞懸液稀釋至5×10⁶個／mL，分裝于細胞培養瓶中，CO₂培養箱中37℃培養24h；

A12總RNA提取；

A13cDNA的合成；

A14引物的設計與合成；

根據GenBank中已報道的大熊貓IL-6cDNA序列，運用引物設計軟件Oligo6.0分別設計兩對擴增IL-6全基因的引物，具體序列如下表所示：

A15目的基因的PCR擴增；

以大熊貓基因組cDNA為模板，IL-6P1／P2為引物進行PCR擴增，反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性40s，60℃退火40s，72℃復性50s，該步驟進行30個循環；72℃延伸10min；于10℃保存；

A1.6目的基因PCR產物的TA克隆；

A161目的片段的回收

A162目的片段與克隆載體連接

將上步回收的產物與pMD18-T?Simple?Vector進行連接，16℃連接過夜；

A163DH5α感受態細胞的制備；

A164連接產物的轉化；

A17重組質粒的初步鑒定；

A171重組質粒的小量提取；

A172重組質粒雙酶切鑒定；

A173核苷酸序列的測定；

將鑒定后的陽性重組質粒菌種保存液送寶生物公司測序；

A2大熊貓白介素6的原核表達、多克隆抗體的制備；

A21引物設計與合成；

根據大熊貓IL-6基因測序結果以及信號肽分析結果，運用0ligo7.0設計引物：IL-6P1／P2，擴增編碼IL-6成熟肽的cDNA堿基序列，引物見下表：

A22目的片段的PCR擴增；

以重組質粒pMD18-T-IL6作為模板，加入特異性引物，進行PCR擴增；反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性40s，60℃退火40s，72℃復性50s，該步驟進行30個循環；72℃延伸10min；于10℃保存；

A23目的基因的TA克隆

A231IL-6的TA克隆

將上步回收的產物與pMD18-T?Simple?Vector進行連接，16℃連接過夜；將上述TA連接液轉化克隆菌DH5α，活化培養后將轉化菌涂布含Amp(50mg／L)的LB固體培養基，置于37℃培養箱中，正置吸附0.5h，然后倒置培養12～24h；

A24重組質粒的初步鑒定；

A25原核表達載體的構建；

A26重組表達菌株的培養及表達；

A27原核表達條件的優化；

A28重組表達蛋白的可溶性檢測。