[發明專利]一種基于腺病毒AdC68的表達載體及其構建方法

在審

• 申請號: 201310362225.7
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103937835A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 周東明;楊勇;丁妙
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于生物技術和病毒學領域；更具體地，本發明涉及一種基于腺病毒AdC68的表達載體及其構建方法。

背景技術

腺病毒(Adenovirus)是一種無包膜、線性化的雙鏈DNA病毒，能夠高效感染各種哺乳動物細胞且易于擴增及純化，被作為基因載體工具廣泛用于分子和細胞生物學研究。腺病毒能在體內有效地誘導強烈的體液免疫和細胞免疫反應，被認為是目前最有應用前景的疫苗載體之一，包括用于研發HPV、HIV，乙肝、丙肝、流感、瘧疾、狂犬病等疾病的疫苗。傳統的腺病毒載體主要是基于人血清型AdHu2和AdHu5，其中AdHu5曾一度被應用于臨床基因治療。然而據血清型調查表明人群中約40-60%的個體中含有抗人血清型腺病毒的中和抗體，導致基于人血清型腺病毒載體的免疫效果受到體內預存的中和抗體很大程度的影響(Singh，N.等，Molecular?therapy:the?journal?of?the?American?Society?of?Gene?Therapy16，965-971，doi:10.1038/mt.2008.12(2008)；Sprangers，M.C.等，Journal?of?clinical?microbiology41，5046-5052(2003))。

目前腺病毒載體的構建策略一般采用同源重組的方法，包括：(1)細胞內同源重組，此方法缺點是易受到親代腺病毒的污染，必須經過2-3次的病毒空斑純化，并通過多次的噬斑形成方法鑒定重組病毒；另外重組效率低下，產生重組的時間至少需要兩周以上。(2)位點特異性重組，缺點是同樣易受親代病毒的污染，需要經過多次病毒空斑純化，由于引入了Cre/loxp重組系統，會增加腺病毒發生遺傳改變的幾率，獲得不穩定的腺病毒子代。(3)細菌內同源重組(如AdEasy^TM?System)，其缺點是篩選陽性克隆比較繁瑣，同時由于引入同源重組方法，腺病毒基因組在大腸桿菌中易發生突變。

因此，本領域技術人員還需要開發新的構建腺病毒載體的方法，以及開發免疫效果理想的腺病毒。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于腺病毒AdC68的表達載體及其構建方法。

在本發明的第一方面，提供一種制備腺病毒表達載體的方法，所述方法包括：將黑猩猩型腺病毒AdC68基因組分成4個片段，依次裝入到骨架載體中，并且，用連接序列替換AdC68基因組中E1的大部份編碼序列；所述的連接序列中，設置酶切位點I-Ceu?I和PI-Sce?I。

在一個優選例中，所述的4個片段分別是：

黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第1-6025位；

黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第6026-17279位；

黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第17280-34196位；和

黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第34197-36519位。

在另一優選例中，各片段的氨基酸位點計算基于GenBank登錄號AC_000011的核苷酸序列。

在另一優選例中，利用Nde?I和SnaB?I兩個酶切位點切除腺病毒E1的大部份編碼序列，大小約為3.5kb，將其替換為含有內切酶I-Ceu?I和PI-Sce?I的Linker片段。

在另一優選例中，所述的骨架載體是pNEB193載體。

在另一優選例中，所述的連接序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

在本發明的另一方面，提供一種腺病毒表達載體，所述表達載體包括：改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因組序列；其中，E1的大部份編碼序列由連接序列(Linker)替換；所述的連接序列中設置酶切位點I-Ceu?I和PI-Sce?I。

在另一優選例中，所述的連接序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

在另一優選例中，所述的腺病毒表達載體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

在另一優選例中，所述表達載體的酶切位點I-Ceu?I和PI-Sce?I之間，還包括外源的抗原編碼基因。

在另一優選例中，所述的外源的抗原是(但不限于)腸道病毒EV71的VP1抗原。

在另一優選例中，所述的VP1抗原的編碼基因的序列如SEQ?ID?NO:4所示。

在本發明的另一方面，提供一種制備疫苗的方法，所述方法包括：

(1)提供所述的腺病毒表達載體；