[發明專利]精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用及方法

有效

• 申請號: 201310361852.9
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103589767A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 陳小鋒;李利佳;李曉平;鄭翔芳;張均;李文佳
• 申請（專利權）人: 宜昌長江藥業有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12R1/84;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵;馮瓊

本申請要求于2012年08月17日提交中國專利局、申請號為201210295925.4、發明名稱為“精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用及方法”的中國專利申請的優先權，其全部內容通過引用結合在本申請中。

技術領域

本發明涉及蛋白表達領域，特別涉及精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量的方法。

背景技術

精氨酸，學名為2-氨基-5-胍基-戊酸，是一種脂肪族的堿性的含有胍基的極性α氨基酸，在生理條件下帶正電荷。L-精氨酸是蛋白質合成中的編碼氨基酸，哺乳動物必需氨基酸和生糖氨基酸，D-精氨酸在自然界中尚未發現。精氨酸中，與主鏈最接近的旁鏈部份是較長、有機及疏水的，而另一端的旁鏈則是一個胍基，這個胍基的酸度系數（pKa值）為12.48，在中性、酸性或堿性的環境下都是帶正電荷的。因為在其雙鍵及氮孤立電子對之間的共軛體系，使得其正電極離開原位，這個胍基能形成多重的氫鍵。

精氨酸的分子結構、電荷分布及形成多重氫鍵的能力，使得它能與帶有負電荷的分子結合。因此，精氨酸在蛋白質的外圍，能在帶電荷的環境下產生相互作用。精氨酸是一氧化氮、尿素、鳥氨酸及肌丁胺的直接前體，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。作為一氧化氮的前體，精氨酸可以協助舒張血管。非對稱性二甲基精氨酸（ADMA）會壓抑一氧化氮的化學作用，所以ADMA被認為是血管疾病的標記，就像精氨酸是健康內皮細胞層的象征一樣。細胞培植研究指出當有機體外（試管內）賴氨酸與精氨酸的比例偏向賴氨酸時，可以壓抑病毒的復制。在治療上的成效卻是未知的，但食用精氨酸會影響注射賴氨酸的效用。病人在進行手術(如膽囊切除術)以前，如先補充30g的精氨酸，會使病人維持正氮平衡而易于恢復.對腫瘤病人在進行大手術前鼻飼勻膳時，補充25g的精氨酸比補充同樣氮含量的甘氨酸有效得多，更易于保持氮的正平衡.要使精氨酸發揮上述功效，其劑量較大甚至要達到每千克體重0.5g。

氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽，例如甘精胰島素前體和豬蛔蟲抗菌肽cecropin?P1，序列中含有連續的兩個精氨酸。甘精胰島素，化學名稱為21A－Gly-30Ba-L-Arg-30Bb-L-Arg-人胰島素，分子式為C₂₆₇H₄₀₄N₇₂O₇₈S₆，分子量為6063。甘精胰島素是一種在中性pH液中溶解度低的人胰島素類似物。在胰島素與其受體結合的動力學方面，甘精胰島素同人胰島素極為相似。因此可以認為它與經由胰島素受體而介導胰島素的作用相同，其主要作用是調節糖代謝。通過促進骨骼肌和脂肪等周圍末梢組織攝取葡萄糖、抑制肝葡萄糖的產生而降低血糖的。臨床藥理學的研究表明，靜脈注射等劑量的甘精胰島素和人胰島素，其效價是相同的。像所有的胰島素一樣，甘精胰島素的作用時程可能受體力活動及其他因素的影響。對健康人及I型糖尿病患者的正常血糖鉗夾研究表明，皮下注射甘精胰島素的起效時間比低精蛋白鋅人胰島素（NPH）胰島素慢，但甘精胰島素的作用特性為平穩、無峰值、作用時間長。甘精胰島素前體經過酶切純化后即可獲得甘精胰島素。而甘精胰島素前體的表達，與胰島素的表達方法相似，可以參照專利US5656722、US4916212、CN1614019和CN1854299等。實驗發現，甘精胰島素前體與胰島素前體相比，表達量較低。

豬蛔蟲抗菌肽cecropin?P1是一種具有廣譜抗菌作用的抗菌肽，能夠有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長。重組豬蛔蟲抗菌肽cecropin?P1有希望在飼料中的獲得應用。

通常，通用的發酵培養基或培養液中均含有細胞生長以及表達外源蛋白所需的碳源、氮源、無機鹽以及微量元素等成分，但并不一定含有小分子氨基酸。但細胞在大量表達外源蛋白時，如豬蛔蟲抗菌肽cecropin?P1、甘精胰島素前體，其對某種特定氨基酸的需求大幅增加，若不能通過現有營養滿足，那么這種氨基酸將可能成為限制蛋白產量的重要因素。例如當生物合成多肽中出現兩個連續的精氨酸時，可能受到供應的限制，從而在一定程度上制約了多肽生物合成的速度，此多肽的常規表達量較低。因此，在培養基或培養液中直接加入精氨酸，作為重組多肽合成的前體物質，有利于提高多肽的合成速率，促進表達水平的提高。