[發(fā)明專利]分離純化緣管滸苔鐵超氧化物歧化酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310361408.7
• 申請(qǐng)日: 2013-08-19
• 公開（公告）號(hào): CN103387965A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂明生;王淑軍;蔡阮鴻;房耀維;焦豫良;劉姝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 淮海工學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02
• 代理公司: 連云港潤(rùn)知專利代理事務(wù)所 32255
• 代理人: 劉喜蓮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分離純化緣管滸苔鐵超氧化物歧化酶的方法。

背景技術(shù)

超氧化物歧化酶（EC?1.15.1.1）是催化超氧化物自由基陰離子反應(yīng)形成過(guò)氧化氫和分子氧的酶，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，超氧化物歧化酶廣泛分布于各種生物體內(nèi)，如動(dòng)物，植物，微生物等。它具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。超氧化物歧化酶在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標(biāo)；現(xiàn)已證實(shí)，由氧自由基引發(fā)的疾病多達(dá)60多種。它可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的對(duì)細(xì)胞傷害。超氧化物歧化酶廣泛應(yīng)用于食品、化妝和醫(yī)藥領(lǐng)域，海洋來(lái)源的超氧化物歧化酶具有催化溫度低、抗疲勞等特點(diǎn)。從海洋植物出發(fā)，獲得超氧化物歧化酶是今后研究和開發(fā)這類酶的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分離簡(jiǎn)單、節(jié)約成本的分離純化緣管滸苔鐵超氧化物歧化酶的方法。

本發(fā)明所涉及的緣管滸苔是在中國(guó)江蘇省連云港海域的海水中采集得到的，采集樣本時(shí)間為2012年6月中旬。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明是一種分離純化緣管滸苔鐵超氧化物歧化酶的方法，其特點(diǎn)是，其步驟如下：（1）樣品處理：將采集的緣管滸苔先經(jīng)過(guò)海水清洗去除泥沙和其他雜質(zhì)，再用自來(lái)水和去離子分別清洗三次，擠干水；然后剪碎放入勻漿機(jī)中，并按1克滸苔加入3毫升50mM磷酸緩沖液、pH?7.4、含1?mM?EDTA的比例，向勻漿機(jī)中加入4℃的50mM磷酸緩沖液，混勻并充分破碎滸苔細(xì)胞后將勻漿液置于4℃溫度下冷藏2?h，然后取出過(guò)濾，取濾液在12000?g離心力作用下離心20?min，取上清液；

（2）硫酸銨鹽析：向上述上清液中先加入硫酸銨至50%飽和度，在4℃溫度下靜置1?h后，在12000?g離心力作用下離心20?min，取上清液繼續(xù)加入硫酸銨至70%?飽和度,?在4℃溫度下靜置1?h后，在12000?g離心力作用下離心20?min，將沉淀物用10?mM、?pH7.4的磷酸緩沖液溶解并透析得酶液；

（3）離子交換層析：將上述酶液裝入層析柱中，層析柱選用GE?healthcare的Q-sepharose?FF陰離子交換層析填料，安裝到Bio-Rad雙流相快速蛋白層析儀上，柱床先用10?mM?、pH7.4的磷酸緩沖液溶平衡，設(shè)置程序分別進(jìn)樣，樣品的線性洗脫和層析柱再生，線性洗脫溶液的濃度為800?mM氯化鈉，流速0.8?mL/min，收集洗脫液進(jìn)行超氧化物歧化酶和蛋白濃度的檢測(cè)，將有超氧化物歧化酶的洗脫峰的洗脫液合并和超濾濃縮，進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析；

（4）凝膠過(guò)濾層析：將上述洗脫液按程序進(jìn)入GE?healthcare的Superdex?200?10/30?GL層析柱，洗脫液為10?mM、?pH7.4，含150?mM?氯化鈉的磷酸緩沖液，洗脫流速控制為0.3?mL/min，收集洗脫液進(jìn)行超氧化物歧化酶和蛋白濃度的檢測(cè)，將有超氧化物歧化酶的洗脫峰的洗脫液進(jìn)行透析并冷凍干燥得到緣管滸苔鐵超氧化物歧化酶。

本發(fā)明方法簡(jiǎn)單合理，具有良好的可操作性，并且成本低，應(yīng)用該方法將緣管滸苔鐵超氧化物歧化酶純化了103.6倍，回收率為19.1%，最終酶的比活力達(dá)1750?U/mg蛋白。

附圖說(shuō)明

圖1離子交換層析色譜圖。

圖2凝膠過(guò)濾層析色譜圖。

圖3?SDS聚丙稀銑胺凝膠電泳，?泳道1是緣管滸苔超氧化物歧化酶，泳道2是Marker。

圖4?凝膠過(guò)濾層析測(cè)量酶的分子質(zhì)量。

圖5?抑制劑法檢測(cè)超氧化物歧化酶的類型。泳道1：酶經(jīng)去離子水處理，泳道2：酶經(jīng)5?mM氰化鉀處理，泳道3：酶經(jīng)5?mM過(guò)氧化氫處理，泳道4：酶經(jīng)5?mM?SDS處理。

圖6?酶的催化溫度曲線和熱穩(wěn)定性。■表示催化溫度，●表示熱穩(wěn)定性。

圖7?酶的pH穩(wěn)定性圖。

具體實(shí)施方式

以下進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)其權(quán)利的限制。