[發明專利]分離純化緣管滸苔鐵超氧化物歧化酶的方法

有效

• 申請號: 201310361408.7
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103387965A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 呂明生;王淑軍;蔡阮鴻;房耀維;焦豫良;劉姝
• 申請（專利權）人: 淮海工學院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 連云港潤知專利代理事務所 32255
• 代理人: 劉喜蓮

1.一種分離純化緣管滸苔鐵超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，其步驟如下：

（1）樣品處理：將采集的緣管滸苔先經過海水清洗去除泥沙和其他雜質，再用自來水和去離子分別清洗三次，擠干水；然后剪碎放入勻漿機中，并按1克滸苔加入3毫升50mM磷酸緩沖液、pH?7.4、含1?mM?EDTA的比例，向勻漿機中加入4℃的50mM磷酸緩沖液，混勻并充分破碎滸苔細胞后將勻漿液置于4℃溫度下冷藏2?h，然后取出過濾，取濾液在12000?g離心力作用下離心20?min，取上清液；

（2）硫酸銨鹽析：向上述上清液中先加入硫酸銨至50%飽和度，在4℃溫度下靜置1?h后，在12000?g離心力作用下離心20?min，取上清液繼續加入硫酸銨至70%?飽和度,?在4℃溫度下靜置1?h后，在12000?g離心力作用下離心20?min，將沉淀物用10?mM、?pH7.4的磷酸緩沖液溶解并透析得酶液；

（3）離子交換層析：將上述酶液裝入層析柱中，層析柱選用GE?healthcare的Q-sepharose?FF陰離子交換層析填料，安裝到Bio-Rad雙流相快速蛋白層析儀上，柱床先用10?mM?、pH7.4的磷酸緩沖液溶平衡，設置程序分別進樣，樣品的線性洗脫和層析柱再生，線性洗脫溶液的濃度為800?mM氯化鈉，流速0.8?mL/min，收集洗脫液進行超氧化物歧化酶和蛋白濃度的檢測，將有超氧化物歧化酶的洗脫峰的洗脫液合并和超濾濃縮，進行凝膠過濾層析；

（4）凝膠過濾層析：將上述洗脫液按程序進入GE?healthcare的Superdex?200?10/30?GL層析柱，洗脫液為10?mM、?pH7.4，含150?mM?氯化鈉的磷酸緩沖液，洗脫流速控制為0.3?mL/min，收集洗脫液進行超氧化物歧化酶和蛋白濃度的檢測，將有超氧化物歧化酶的洗脫峰的洗脫液進行透析并冷凍干燥得到緣管滸苔鐵超氧化物歧化酶。