[發(fā)明專利]一種提高靈敏度和特異性的定量PCR方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310361195.8
• 申請(qǐng)日: 2013-08-19
• 公開（公告）號(hào): CN103409540A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣國(guó)成;陳旭;陳剛;吳小祝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州吉泰生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海卓陽(yáng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31262
• 代理人: 巫蓓麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及定量PCR技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種提高靈敏度和特異性的定量PCR方法。

背景技術(shù)

實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）就是在PCR擴(kuò)增過程中，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，來實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板進(jìn)行定量及定性分析的一種技術(shù)。qPCR技術(shù)與普通PCR技術(shù)的不同主要在于：普通的PCR人工參與的更多，數(shù)據(jù)可能不是特別準(zhǔn)確，PCR結(jié)束后還需瓊脂糖電泳檢測(cè)；而qPCR是實(shí)時(shí)監(jiān)控檢測(cè)，無需后期電泳，因此qPCR具有檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、特異性高、重復(fù)性好、靈敏度高、分辨率高、檢測(cè)范圍較廣、定量精確等優(yōu)點(diǎn)。由于qPCR技術(shù)具備較多優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)應(yīng)用到生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，例如基因的差異表達(dá)分析、SNP檢測(cè)、等位基因的檢測(cè)、藥物開發(fā)、臨床診斷、轉(zhuǎn)基因研究等。

qPCR的定量原理涉及到幾個(gè)重要的參數(shù)：Ct值，闕值，基線。一般來說，第3～15個(gè)循環(huán)的熒光值就是基線。閾值一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。Ct值就是熒光值達(dá)到閾值時(shí)候的PCR循環(huán)次數(shù)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，DNA模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系（線性方程為Ct=-KlogN_0?+B，其中N₀是模板起始拷貝數(shù)），所以成為定量的依據(jù)。qPCR的定量又分為：絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。

qPCR有兩步法、三步法等多種方法，經(jīng)典的三步法是變性、退火、延伸三步。兩步法是將退火與延伸采用同一個(gè)溫度將二者合并為一步，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，該方法對(duì)酶的要求較高，三步法得到的數(shù)據(jù)相對(duì)更準(zhǔn)確。具體用哪一種方法，要結(jié)合引物退火溫度、酶的特性、具體試驗(yàn)方案進(jìn)行選擇。

不管是絕對(duì)定量還是相對(duì)定量，用三步法還是兩步法，qPCR技術(shù)的核心是擴(kuò)增過程中有熒光發(fā)出，常用熒光染料有SYBR?Green、GelRed、GelGreen、GoldView^TM或GeneFinder^TM，只有保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步，才能確保檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。在qPCR檢測(cè)過程中經(jīng)常碰到非特異性擴(kuò)增問題，非特異性擴(kuò)增就是擴(kuò)增出了目的條帶以外的條帶，出現(xiàn)假陽(yáng)性和高背景的結(jié)果。

因此，需要一種靈敏度高、特異性好的定量PCR方法，關(guān)于本發(fā)明的定量PCR方法，目前還未見有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種提高靈敏度和特異性的定量PCR方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種提高靈敏度和特異性的定量PCR方法，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料Gelgreen?I和熱啟動(dòng)hTaq酶，所述的熒光染料Gelgreen?I能特異性地結(jié)合DNA雙鏈而發(fā)出熒光信號(hào)，而不結(jié)合DNA鏈的Gelgreen?I?染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

所述的熒光染料Gelgreen?I的工作濃度為0.5×～1×，所述熱啟動(dòng)hTaq酶的工作濃度為0.01～0.1U/μL。

所述的PCR反應(yīng)體系還包括PCR緩沖液、dATP溶液、dUTP溶液、dGTP溶液、dCTP溶液、PCR保護(hù)劑、鎂離子和無菌雙蒸水。

所述的PCR反應(yīng)體系還包括PCR緩沖液、正向引物、反向引物、dATP溶液、dUTP溶液、dGTP溶液、dCTP溶液、PCR保護(hù)劑、鎂離子和無菌雙蒸水。

所述的dATP溶液、dUTP溶液、dGTP溶液或dCTP溶液的工作濃度為100～200μmol/L。

所述的PCR保護(hù)劑是小牛血清白蛋白、明膠、Tween?20或二硫蘇糖醇。

所述的PCR保護(hù)劑更優(yōu)選為小牛血清白蛋白。

本發(fā)明PCR反應(yīng)體系中DNA模板量為：以25μL反應(yīng)體系計(jì)，基因組10～1000ng，或者質(zhì)粒1～30ng，或者RT-PCR反應(yīng)后的cDNA?1～2μL；鎂離子濃度為1.5～2.0mmol/L。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明提供的靈敏度高、特異性好的定量PCR方法，使用熱啟動(dòng)hTaq酶，合適的鎂離子濃度，能很好地抑制非特異性擴(kuò)增，避免假陽(yáng)性和高背景的結(jié)果，溶解曲線能獲得單一峰；熒光染料Gelgreen?I?價(jià)格低廉，使用方便，通用性好，靈敏度非常高，適用于qPCR技術(shù)；本發(fā)明為分子生物學(xué)研究提供了一種新的定量PCR方法。