[發明專利]一種快速檢測美國白蛾的試劑盒

有效

• 申請號: 201310361163.8
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103451281A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 詹國輝;陳景云;鄭斯竹;高淵;陳云芳;鄧海娟;趙毓郎;葛華林
• 申請（專利權）人: 蘇州市外來有害生物防控技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術領域

本發明屬于美國白蛾檢測技術領域，具體涉及一種快速檢測美國白蛾的試劑盒。

背景技術

美國白蛾[Hyphantria?cunea?(Drury)]又名秋幕毛蟲、秋幕蛾，屬鱗翅目（Lepidortera）、燈蛾科（Arctiidae）、燈蛾亞科（Arctiinae），是世界著名的檢疫性有害生物。原產于北美洲，分布于美國、加拿大、墨西哥等地區，1940年傳入歐洲，1945年傳入日本，1958年傳入韓國，1979年傳入我國遼寧丹東。目前，國內公布的疫區有北京、天津、河北、山東、遼寧、陜西、江蘇等省市。國務院辦公廳曾多次下發文件，要求大力加強美國白蛾查防治理工作。2007年美國白蛾被納入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。

在美國，美國白蛾有2個種，分別是黑頭種和紅頭種，而我國主要分布的是黑頭型。由于該蟲繁殖力強大，傳播途徑廣泛，寄主種類繁多，食性龐雜，食量巨大，生態適應性強，危害程度嚴重，是我國農、林、果、蔬業的重要害蟲。據趙鐵珍等人于2004年研究評估全國美國白蛾疫區的非經濟損失（環境功能損失、景觀美學損失、生產生活損失、心理影響損失、生態系內部失衡損失、區域聲譽損失）合計為140.35億元。所以說，準確的種類鑒定是防止美國白蛾侵入非疫區，保護非疫區生態環境的重要手段。

美國白蛾成幼蟲與燈蛾科其他種類在形態上極難區分，尤其是口岸檢疫時截獲美國白蛾的卵或不完整的蟲體，利用傳統的形態分類更難做出快速準確的鑒定。因此需要開發出精準的美國白蛾檢測方法。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種快速檢測美國白蛾的試劑盒，使其具有準確穩定、操作方便、特異性強等特點，滿足使用需求。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種快速檢測美國白蛾的試劑盒，至少包括1次用量以上的特異性引物COI01?/02或SpmR01/02試劑；所述的特異性引物COI01?/02與SpmR01/02序列如下：

COI01序列：5'-CAGGAACTGGATGAACA-3'，

COI02序列：5'-CCTACTGCTCATACGAA-3'，

SpmR01序列：5'-ACGCTGTTGTCCGTATTT-3'，

SpmR02序列：5'-CTGATTTCTTCGGTGTTG-3'。

所述的快速檢測美國白蛾的試劑盒，由1次用量以上的下列試劑組成：

Taq?buffer，MgCl₂，dNTP?mix，Taq?DNA?聚合酶，特異性引物COI01?/02或SpmR01/02，ddH2O。

所述的快速檢測美國白蛾的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

1）DNA的制備：采用GenMagBio?動物細胞組織/細胞基因組DNA?磁珠提取試劑盒提取待檢測樣品和美國白蛾標準對照樣的DNA；

2）PCR反應體系與反應條件

50μL反應體系組成：5μL?10×Taq?buffer、2?mmol/L?MgCl₂、200?μmol/L?dNTP?mix、2U?Taq?DNA?聚合酶、3μL?DNA模板、特異性引物COI01?/02和/或SpmR01/02各1?μmol/L，ddH2O補齊；

反應程序為：94℃預變性2?min；94℃變性1?min、52℃復性30?s，72℃延伸30?s，進行30個循環；72℃延伸5?min；4℃保存；

3）PCR結果判定

混合8?μLPCR產物與2?μL?6×Glycerol?DNA?loading?Buffer上樣，以DNA?Marker?DL100為分子量標記，室溫下恒壓120?V，用3?%瓊脂糖凝膠電泳45?min，0.5%?μmol/L的EB染色，凝膠成像系統檢測樣品，拍照；照片顯示美國白蛾標準對照樣有清晰的擴增條帶，待檢測樣品也具有相同條帶即為美國白蛾，否則不是美國白蛾。

步驟1）中，DNA提取的具體過程如下：