[發明專利]一種快速檢測美國白蛾的試劑盒

有效

• 申請號: 201310361163.8
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103451281A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 詹國輝;陳景云;鄭斯竹;高淵;陳云芳;鄧海娟;趙毓郎;葛華林
• 申請（專利權）人: 蘇州市外來有害生物防控技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

1.一種快速檢測美國白蛾的試劑盒，其特征在于，至少包括1次用量以上的特異性引物COI01?/02或SpmR01/02試劑；所述的特異性引物COI01?/02與SpmR01/02序列如下：

COI01序列：5'-CAGGAACTGGATGAACA-3'，

COI02序列：5'-CCTACTGCTCATACGAA-3'，

SpmR01序列：5'-ACGCTGTTGTCCGTATTT-3'，

SpmR02序列：5'-CTGATTTCTTCGGTGTTG-3'。

2.根據權利要求1所述的快速檢測美國白蛾的試劑盒，其特征在于，由1次用量以上的下列試劑組成：

Taq?buffer，MgCl₂，dNTP?mix，Taq?DNA?聚合酶，特異性引物COI01?/02或SpmR01/02，ddH2O。

3.權利要求1所述的快速檢測美國白蛾的試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）DNA的制備：采用GenMagBio?動物細胞組織/細胞基因組DNA?磁珠提取試劑盒提取待檢測樣品和美國白蛾標準對照樣的DNA；

2）PCR反應體系與反應條件

50μL反應體系組成：5μL?10×Taq?buffer、2?mmol/L?MgCl₂、200?μmol/L?dNTP?mix、2U?Taq?DNA?聚合酶、3μL?DNA模板、特異性引物COI01?/02或SpmR01/02各1?μmol/L，ddH2O補齊；

反應程序為：94℃預變性2?min；94℃變性1?min、52℃復性30?s，72℃延伸30?s，進行30個循環；72℃延伸5?min；4℃保存；

3）PCR結果判定

混合8?μLPCR產物與2?μL?6×Glycerol?DNA?loading?Buffer上樣，以DNA?Marker?DL100為分子量標記，室溫下恒壓120?V，用3?%瓊脂糖凝膠電泳45?min，0.5%?μmol/L的EB染色，凝膠成像系統檢測樣品，拍照；照片顯示美國白蛾標準對照樣有清晰的擴增條帶，待檢測樣品也具有相同條帶即為美國白蛾，否則不是美國白蛾。

4.根據權利要求3所述的快速檢測美國白蛾的試劑盒的檢測方法，其特征在于：步驟1）中，DNA提取的具體過程如下：

直接剪取供試標本足和胸部30mg放入2mL試管，無水乙醇浸泡保存標本用無菌蒸餾水沖洗浸泡4~5次，棄水；干標本無菌蒸餾水浸泡3h后吸干水分；置于2mL離心管，MM400球磨儀中震蕩碾磨（30次/s）30s，加入180μL?Lysis?Buffer、20μL?Proteinase?K，震蕩混勻，常溫過夜，55℃震蕩溫浴3-5h，12000rpm離心10min，取上清，加入200μL?Binding?Buffer和200μL無水乙醇，充分混勻，加入20μL磁珠，輕柔顛倒混勻10min；離心管置于磁力架，吸棄管內液體，保留磁珠，Wash?Buffer???500uL顛倒混勻2min置于磁力架，棄去管內液體，Wash?Buffer?Ⅱ同樣洗滌兩次，離心管仍置于磁力架上，緩慢加入Wash?Buffer?Ⅲ，1min后移走管內液體；加入20μL?Elution?Buffer，55℃水浴10min洗脫磁珠上吸附的DNA，4℃儲存備用。