[發明專利]一株共生真菌及其在鐵皮石斛組培與種植階段的應用

無效

• 申請號: 201310361106.X
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103421695A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 虞龍;姚馳亞
• 申請（專利權）人: 虞龍
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N15/01;A01H4/00;A01G31/00;C12R1/645
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 王月霞

技術領域

本發明涉及一株共生真菌及其在鐵皮石斛組培與種植階段的應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

鐵皮石斛又稱黑節草，屬蘭科石斛屬，為蘭科多年生附生草本植物，是一種珍貴的野生藥用植物。鐵皮石斛具有獨特的藥用價值，秦漢時期的《神農本草經》記載鐵皮石斛“主傷中、除痹、下氣、補五臟虛勞羸瘦、強陰、久服厚腸胃”。現代研究表明鐵皮石斛具有抗腫瘤活性；能顯著降低血糖水平，促進循環、擴張血管、降低血膽固醇和甘油三酯；對于防治老年白內障和保護少兒視力也有明顯效果;具有抗氧化、抗誘變活性等作用。

[0003]由于野生鐵皮石斛對自然生態條件要求極其苛刻，自然繁殖率又極低，早在上個世紀八十年代，鐵皮石斛就被國家列為重點保護的珍惜瀕危藥用植物。鐵皮石斛同時也是一種真菌共生植物，這些真菌提高了鐵皮石斛對養分的吸收能力，同時能促進鐵皮石斛的生長。通過菌種誘變，并且篩選出優良的共生菌種，不僅可以促進種子萌發，提高組培苗的出瓶成活率和生長速度，而且還能提供礦物營養、產生維生素和激素類物質等，從而促進鐵皮石斛的生長發育。

發明內容

本發明的目的是提供一株鐵皮石斛的共生真菌，使鐵皮石斛在組培和大田培養階段存活率，生長速率大幅度提高。

為了達到上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一株共生真菌(Epulorhiza?sp.)?Es-N235，已于2013年6月21日保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號：CCTCC?NO：M?2013274。

所述的共生真菌Es-N235在鐵皮石斛組培與種植階段的應用。

本發明所述的共生真菌的篩選方法是：從浙江雁蕩山野生鐵皮石斛新鮮營養根中分離純化得到共生真菌瘤菌根菌作為出發菌株，經低能氮離子注入誘變后，利用PDA培養基，挑選出誘變后的共生真菌，再利用共生培養，篩選出能夠提高組培存活率的菌株，再通過大田無土栽培復篩，篩選出能夠縮減生長周期，提高種植存活率的菌株作為下一輪誘變的出發菌株。重復上述過程，直到篩選出目標菌株Es-N235。

本發明菌株Es-N235的形態學及生理化學特征如下：

???菌落顏色：米白色；?????????????????

???需氧方式：兼性厭氧；

???菌落大小：6~10mm；

???適宜生長溫度：25~30℃；

???適宜生長PH：6.0~7.0；

???菌落形態：圓形；

???革蘭氏染色：陽性。

???本發明所提供的共生真菌Es-N235誘變方法，具體步驟如下

?（a)、單孢子懸浮液制備：將出發菌株孢子制成孢子懸液，調整孢子濃度為10⁶/毫升。

（b)、低能氮離子注入誘變：取0.1ml的步驟(a)中孢子懸液均勻涂布于無菌平皿上，以無菌風吹干，在25KeV,注入劑量為160×10¹³ions/cm³下對其進行氮離子注入。離子注入完畢后，取出平皿，在無菌條件下用1ml無菌水洗脫，涂布到PDA培養基上，在25~30℃下倒置培養2~3d。

（c)菌種擴大培養：將步驟(b）PDA培養基培養的共生真菌接種至斜面培養基培養，培養溫度為25~30℃，培養時間為2~3d；再將共生真菌的斜面培養物接種至種子培養基培養，培養溫度為25~30℃。搖瓶裝液量10%~30%。培養時間12~24h；

(d）共生培養初篩：將步驟（c）擴大培養后的菌種接入鐵皮石斛無菌組培的培養基共同培養，光照強度3000~8000Lux，篩選共生效率高，鐵皮石斛苗存活效率、生長速率都提高的菌株。

（e）大田種植復篩：將步驟（d）中篩選出的共生培養植株移植到大田培養，培養溫度25~30℃，光照強度5000~8000Lux，光照時間12~16h/d。篩選共生效率高，鐵皮石斛植株大田存活率、生長速率都提高的菌株作為下一輪誘變的出發菌株。

重復上述過程，直到篩選出目標菌株Es-N235。

在上述篩選方法中：步驟（b)所采用的PDA平板培養基包含如下質量百分數成分：馬鈴薯煮汁20%~30%，碳源5%~10%,無機鹽0.03%~0.1%，瓊脂1%~3%，其余為水，培養溫度為25~30℃；其中所述碳源為葡萄糖，蔗糖中的一種或多種混合；所述無機鹽為鈉鹽，鉀鹽，或者鎂鹽中的一種或幾種混合。