[發明專利]一種檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌的核酸側向流試紙條的制備方法及其應用

無效

• 申請號: 201310360915.9
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103789404A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 鄭文杰;李宗夢;張宏偉;劉培;曲鵬;奚文輝;郝育杰;尹長城;劉斯奇
• 申請（專利權）人: 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學和免疫學領域，涉及食品及加工原料中小腸結腸炎耶爾森氏菌的核酸擴增產物側向流免疫膠體金試紙條試劑盒的制備和應用方法。

背景技術

為有效控制食品生產和進出口貿易中因致病性微生物引起的食源性疾病，保證食品領域的公共安全，需要開發靈敏、便捷、準確的食源性病原微生物檢測方法。在食源性疾病危險因素中，在我國流行的食源性疾病中，微生物性食物中毒位居第一，而在食源性病原微生物中其中最典型的致病菌是小腸結腸炎耶爾森氏菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球、單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7等病原菌。小腸結腸炎耶爾森氏菌是人和動物腸道內寄生的一種革蘭氏陰性菌，屬腸桿菌科耶爾森菌屬，是腸道正常菌叢中的一種，在一定條件下可引起人和動物致病，引起胃腸道癥狀外，還能引起呼吸系統、心血管系統、骨骼結締組織等疾患，甚至可引起敗血癥，造成死亡。該菌還是重要的食源性致病菌，很多國家都已將該菌列為進出口食品的常規檢測項目。

在傳統的食品生產、質量監督和進出口檢驗檢疫中常規的細菌培養及鑒定方法，檢驗步驟繁瑣，檢驗周期長，同時對于有些細菌仍無法給出快速和準確的鑒定，不能完全滿足農產品及進出口檢驗檢疫的檢測要求?；诤怂釘U增的方法檢測對象是來自病原微生物的DNA，經特異性擴增后進行產物鑒定，這類方法因靈敏度高，特異性好，耗時少而發展迅速。

熒光定量PCR技術是一種高靈敏度核酸檢測和定量方法，基本原理是在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷積累，熒光信號強度也等比例增加。熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、自動化程度高、無污染性，具有實時性和準確性等特點，特別是依賴探針結合的TaqMan方法，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域。公開號為??的發明專利“一種檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌熒光PCR試劑盒”提供了一種利用TaqMan探針法進行小腸結腸炎耶爾森氏菌檢測的引物和探針設計方法，“病原微生物檢測用引物和使用所述引物的多重擴增”（公開號：CN101113475）同時設計了可檢測霍亂弧菌、致病性大腸桿菌、空腸彎曲菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、副溶血弧菌、沙門菌、志賀菌和李斯特菌的多條引物用于多重PCR，結果需要經凝膠電泳分析。實時定量PCR檢測對設備依賴性強，難以實現現場檢測，常規的PCR擴增檢測需要對PCR產物凝膠電泳后進行圖像采集和分析，耗費時間較長，且難以保證檢測的靈敏度?；蛐酒椒ㄔ谠摫痹肺锏臋z測中也有運用，公開號為CN102311993?的發明專利“用于檢測水產品中重要致病菌的基因芯片及其試劑盒”及公開號為CN102140507的發明專利“用于感染性腹瀉的檢測型基因芯片及檢測用試劑盒”各自提供了用于基因芯片的引物設計和檢測方法，但基因芯片的設備依賴性限制了其應用范圍，并且往往需要預擴增技術，增加了實驗流程。

另一類檢測方法是基于雙抗體夾心的免疫學檢測方法，其檢測對象主要是蛋白質分子，競爭法檢測的對象為小分子化合物和半抗原分子，這兩種免疫學檢測方法都可以用免疫膠體金試紙條的方法實現，是快速檢測的常規方法，具有快速、簡單、成本低廉的優點，廣泛用于食品中毒素、病原微生物以及農藥、抗生素殘留的篩查。過去病原微生物的免疫學檢測主要依據上述抗原與抗體的結合反應，用酶聯免疫吸附（ELISA）方法或免疫膠體金膠體金試紙條或完成檢測。在免疫膠體金檢測中，利用抗原和抗體的特異性結合的特點，形成抗原一抗體一有色顆粒復合物而富集在包被線上，形成肉眼可見的有色沉淀線，對蛋白的檢測依賴高親和力和高特異性抗體的獲得，在病原物分析時因為基因編碼的規律和簡并規則，DNA較蛋白質更易于產生序列差異，這種差異也更易于準確檢出，通過將免疫學檢測的方法移植于核酸產物檢測可以有效提高核酸產物的檢測效率，通過在PCR擴增引物中引入特殊的標記物就可以實現雙鏈產物的免疫學檢測。