[發(fā)明專利]利用鏈格孢屬微生物胞內(nèi)酶轉(zhuǎn)化葡萄糖生成白藜蘆醇的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310359908.7
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103484505A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 師俊玲;車金鑫
• 申請（專利權(quán)）人: 師俊玲
• 主分類號: C12P7/22
• 分類號: C12P7/22;C12R1/645
• 代理公司: 西安新思維專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 61114
• 代理人: 韓翎

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明屬于芪類化合物生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用鏈格孢屬微生物胞內(nèi)酶轉(zhuǎn)化葡萄糖生成白藜蘆醇的方法。?

背景技術(shù)

白藜蘆醇是具有多種生理活性的植物芪類化合物，具有預(yù)防和減緩癌癥、心血管疾病及缺血性損傷等多種疾病的功能，并有增強(qiáng)抗逆性和延長從酵母到脊椎動物多種生物生命的功效。同時(shí)，白藜蘆醇是是生產(chǎn)酰化白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇等其它功能活性物質(zhì)的重要的前體，在功能食品加工和藥物生產(chǎn)方面有著廣泛應(yīng)用，市場需求量大。?

目前，白藜蘆醇的生產(chǎn)主要依賴于從植物中直接提取。其中能夠廣泛用于生產(chǎn)的主要植物是中藥材野生虎杖的根莖。隨著大量生產(chǎn)的需要，虎杖原料已十分緊缺，嚴(yán)重地限制了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。雖然白藜蘆醇也可以通過化學(xué)合成方法獲得，但其反應(yīng)過程中涉及有毒有害物質(zhì)的大量使用和殘留，存在安全問題。生物合成法生產(chǎn)白藜蘆醇主要局限于植物細(xì)胞和微生物培養(yǎng)法的應(yīng)用，但是存在生產(chǎn)周期長，受生物細(xì)胞生產(chǎn)狀態(tài)影響大，產(chǎn)量不穩(wěn)定的問題。?

酶法合成白藜醇屬于生物合成方法，既可以避免有毒有害物質(zhì)的殘留問題，又可以擺脫生物細(xì)胞生長狀態(tài)的影響，而且反應(yīng)體系簡單、反應(yīng)速度快，生產(chǎn)過程可控制性強(qiáng)，生產(chǎn)周期短。同時(shí)，固定化酶還具有可重復(fù)利用的優(yōu)點(diǎn)。具有很好的應(yīng)用前景。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種方法操作簡單、轉(zhuǎn)化速率快、環(huán)保、生產(chǎn)成本低、可工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)白藜蘆醇的利用鏈格孢屬微生物胞內(nèi)酶轉(zhuǎn)化葡萄糖生成白藜蘆醇的方法。?

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：?

利用鏈格孢屬微生物胞內(nèi)酶轉(zhuǎn)化葡萄糖生成白藜蘆醇的方法，其特征在于：

由以下步驟實(shí)現(xiàn)：

步驟一：酶液的制備：

（1）將鏈格孢屬CCTCC?No:?M2011348菌株接種于液體培養(yǎng)基中，在28℃、120?rpm的條件下培養(yǎng)4天；

（2）取培養(yǎng)物用過濾法收集菌絲體，并用蒸餾水沖洗干凈；

（3）將所得菌絲體在液氮中研磨破碎，按每4.0?g?菌絲體加入8?ml粗酶提取液的比例加入粗酶提取液，混合均勻后，在溫度4℃、轉(zhuǎn)速1000rpm的條件下離心10min，收集上清液；

（4）在上清液中加入固體硫酸銨至其飽和濃度為75%，4℃靜置過夜后在1000rpm轉(zhuǎn)速下離心10?min，收集沉淀并用（3）中的粗酶提取液溶解后放入透析袋中，在4℃透析至無SO₄^2－檢出為至，透析袋中所得液體即為粗酶液；

步驟二：生成白藜蘆醇：

取100?mL緩沖液，加入步驟一得到的粗酶液5-50?mL，在溫度37℃、轉(zhuǎn)速120?rpm的條件下反應(yīng)0.5～4?h，得到白藜蘆醇。

步驟一（1）中，所述液體培養(yǎng)基為土豆汁葡萄糖液體培養(yǎng)基，配方為：?20%的馬鈴薯浸汁1000mL，葡萄糖20?g，pH?自然。?

步驟一（3）中，所述粗酶提取液為磷酸鹽緩沖溶液，摩爾濃度為50mmol/L，?pH為7，其中含有0.1g/L硫酸鎂、0.2g/L硫酸鈣、0.6mmol/L?DTT。?

步驟一中，得到的粗酶液制備成固定化酶，具體步驟為：?

在200mL燒杯中加入2g海藻酸鈉和50ml蒸餾水，加熱攪拌，使其完全混合，待冷卻后，加入10mL步驟一得到的粗酶液混合，用注射器滴入1%氯化鈣溶液中，放置在4℃環(huán)境中固定化1?h后，用蒸餾水清洗數(shù)遍放置于4℃蒸餾水中保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟二中，所述緩沖液為含有0.1?g/L硫酸鎂、0.2?g/L硫酸鈣和0.5-10.0?mmol/L葡萄糖的50?mmol/L的磷酸緩沖溶液、0.1mol/L檸檬酸緩沖溶液或50?mmol/L?Tris-HCl緩沖溶液，pH為3-7.5。?

步驟二中，反應(yīng)體系中分別加入0.2?mg/100?mL的丙二酰輔酶A、ATP、輔酶A、對-香豆酸或苯丙氨酸。?

????本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：?

本方法操作簡單、生產(chǎn)時(shí)間短，利用鏈格孢屬微生物的胞內(nèi)酶為催化劑，以葡萄糖為底物，在溫和的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化合成白藜蘆醇，安全環(huán)保；利用酶法生物轉(zhuǎn)化合成白藜蘆醇，可在數(shù)小時(shí)之內(nèi)完成反應(yīng)，生產(chǎn)效率高；利用酶法生物轉(zhuǎn)化合成白藜蘆醇，可以擺脫生物細(xì)胞生長狀況對產(chǎn)物得率的影響，可控性強(qiáng)；利用酶法轉(zhuǎn)化葡萄糖合成白藜蘆醇，生產(chǎn)成本低；利用固定化酶法生物轉(zhuǎn)化合成白藜蘆醇，可以實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)利用，大大降低生產(chǎn)成本，同時(shí)能夠有效提高PDG的生產(chǎn)效率，為工業(yè)化生產(chǎn)提供新的思路和途徑。?

附圖說明