[發明專利]檢測小麥籽粒α-Amy3基因表達量的引物及其應用

有效

• 申請號: 201310359300.4
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103409534A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 鄭有良;劉亞西;王際睿;楊劍;江千濤;蒲至恩;陳國躍;魏育明
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及小麥分子標記輔助育種技術領域，特別涉及一種檢測小麥籽粒第三類α-淀粉酶基因（α-Amy3）表達量的引物及其應用。

背景技術

小麥穗發芽(Pre-harvest?sprouting，簡稱PHS)是指收獲前遇到陰雨或在潮濕環境下籽粒在穗上發芽的現象。穗發芽是一種世界性的重要災害，主要發生在收獲季節易降雨的地區。小麥穗發芽可造成產量損失達10%以上，嚴重時會絕收。由于穗發芽的進展和后果都與內源α-淀粉酶的活性提高有密切關系。大多數研究學者認為，低α-淀粉酶活性是抗穗發芽的主要機理，低表達α-淀粉酶基因是抗穗發芽分子育種的首選途徑（Sarah?De?Laethauwer,Jan?De?Riek.a-Amylase?gene?expression?during?kernel?development?in?relation?to?pre-harvest?sprouting?in?wheat?and?triticale.Acta?Physiol?Plant,2013,DOI10.1007/s11738-013-1323-9；何震天,陳秀蘭,韓月澎.白皮小麥抗穗發芽研究進展.麥類作物學報2000，20:84-87；秦代紅.小麥抗穗發芽生理.植物生理學通訊.1990,6:62-64；肖世和,張秀英.白粒小麥抗穗發芽遺傳育種的研究.作物雜志.1999,2:5-6；張海峰，盧榮禾.小麥穗發芽抗性機理與遺傳研.作物學報,1993,6:523-530）。

小麥種子發芽相關的α-淀粉酶有三類：一類為麥芽/發芽α-淀粉酶(α-Amy1)，受第6同源染色體的α-Amy1基因控制，主要在發芽籽粒中表達；另一類為綠色/種皮α-淀粉酶(α-Amy2)，受第7同源染色體的α-Amy2基因控制，主要在發育的種皮中表達，表達時間為發芽的晚期即浸水后的5-6d表達；還有α-Amy3同功酶（編碼基因為α-Amy3）也在發育的種皮中被檢測到（王際睿.小麥種子蛋白及赤霉病抗性相關基因的分子鑒定.四川農業大學博士學位論文.2008）。利用分子標記技術，檢測α-淀粉酶基因的表達量，可以判斷種子內α-淀粉酶的數量，為抗穗發芽種質資源篩選提供參考，加速抗穗發芽分子育種。

實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied?Biosystems公司在傳統的PCR技術基礎上發展起來的一種新的核酸定量技術。實時熒光定量PCR方法是根據熒光共振能量轉移原理，設計相應的熒光標記核酸探針，通過PCR反應對相應DNA進行定性定量測定的技術。該技術具有定量準確、靈敏度高、重復性好、高通量等特點，已被廣泛應用于基因的表達量檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測小麥籽粒α-Amy3基因表達量的引物及其應用。

本發明提供了一種檢測小麥籽粒α-Amy3基因表達量的引物，其核苷酸序列如下：

Amy3-F1:5’-TCGCCGACATCGTCATCAAC-3’（SEQ?ID?No.1）；

Amy3-R1：5’-GTGCCGTCGGAGTAGGTGGT-3’（SEQ?ID?No.2）。

上述引物為熒光標記引物，還配合使用熒光染料，其熒光染料為SYBR?Green?I。

所述檢測小麥籽粒α-Amy3基因表達量的引物Amy3-F1/R1通過如下方法得到：

（1）從NCBI數據庫中獲得大麥α-Amy3編碼基因序列（FN179391.1），利用BLAST-n程序搜尋相關序列資源，對獲得的序列資源進行鑒定，篩選得到SEQ?ID?No.3所示的序列進行深入分析；

（2）設計熒光定量PCR引物，用于后續篩選；

（3）提取待檢測小麥開花后30天籽粒的總RNA（此時種子處于蠟熟期），反轉錄為cDNA；

（4）以步驟（3）所得cDNA為模板，以步驟（2）設計的引物為引導進行實時熒光定量PCR擴增，篩選出溶解曲線符合要求的引物對；

（5）以步驟（3）所得cDNA為模板，以步驟（4）篩選的引物為引導進行普通PCR擴增，對所得擴增產物進行克隆測序，驗證引物是否特異擴增目的基因α-Amy3，最終篩選出特異檢測α-Amy3基因表達量的引物Amy3-F1/R1。

步驟（2）中，利用DNAMAN5.0軟件和Primer5.0軟件設計熒光定量PCR引物，熒光定量PCR引物設計標準為：引物長度在20-24nt，擴增產物長度不超過200bp，退火溫度大于60℃，單條引物之間退火溫度差距在1℃之間，3’端不宜為A，引物自身不形成發卡結構，不形成引物二聚體。