[發明專利]檢測小麥籽粒α-Amy3基因表達量的引物及其應用

有效

• 申請號: 201310359300.4
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103409534A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 鄭有良;劉亞西;王際睿;楊劍;江千濤;蒲至恩;陳國躍;魏育明
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

1.一種檢測小麥籽粒α-Amy3基因表達量的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：

Amy3-F1:5’-TCGCCGACATCGTCATCAAC-3’；

Amy3-R1:5’-GTGCCGTCGGAGTAGGTGGT-3’。

2.根據權利要求1所述的引物，其特征在于，還包括與其配合使用的熒光染料。

3.根據權利要求2所述的引物，其特征在于，所述熒光染料為SYBR?GreenI。

4.含權利要求1-3任意一項所述引物的檢測試劑盒。

5.根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，其還包括：cDNA裂解液、陰性模板和/或陽性模板。

6.一種檢測小麥籽粒α-Amy3基因表達量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

（1）提取待檢測小麥樣品開花后30天籽粒的總RNA，反轉錄為cDNA；

（2）以步驟（1）所得cDNA為模板，以Amy3-F1和Amy3-R1為引導進行PCR擴增，將擴增產物克隆至T載體并轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆并測序；

（3）從測序正確的陽性克隆中提取質粒，將梯度稀釋后的質粒樣品作為標準模板，以引物Amy3-F1和Amy3-R1為引導進行實時熒光定量PCR，繪制標準曲線，設置閾值；

（4）以待檢測小麥樣品的cDNA為模板，對內參基因進行實時熒光定量PCR擴增，獲得相應的擴增效率e及Ct值，計算內參基因的表達量e^-ΔΔt，用于后續待檢測小麥樣品cDNA濃度的校正；

（5）利用引物Amy3-F1和Amy3-R1，與步驟（4）同時對待檢測小麥樣品的cDNA進行實時熒光定量PCR擴增，根據反應結果確定小麥樣品對應的Ct值和擴增效率E，計算小麥樣品α-Amy3基因的表達量E^-ΔΔt，進一步利用內參基因的表達量e^-ΔΔt進行校正，獲得能夠進行樣品間比較的相對表達量E^-ΔΔt/e^-ΔΔt；

（6）比較不同小麥樣品種子中α-Amy3基因的相對表達量，判斷種子的萌發特性。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，反轉錄為cDNA的PCR反應體系為：

4μl5×PrimeScript緩沖液、1μl?Oligo?dT引物、1μl隨機的6核苷酸引物、1ul?PrimeScript?RT?Enzyme?Mix?I酶、2μl模板總RNA、加無RNA的ddH₂O至總體積為20μl；

反轉錄為cDNA的PCR反應程序為：37℃15min，85℃5s，12℃保溫。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，以所述cDNA為模板，以Amy3-F1和Amy3-R1為引導進行PCR擴增，PCR反應體系為：5μl10×PCR緩沖液、1.5U?Ex?Taq^TM?DNA聚合酶、2mmol/L?MgCl₂、0.2mmol/L?dNTP、引物各150ng、100ng模板cDNA、雙蒸水加至總量為50μl；

PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，共35個循環；72℃延伸5min。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（3）、（4）、（5）中，以所述質粒樣品或cDNA為模板，以Amy3-F1和Amy3-R1或相應的內參引物為引導進行實時熒光定量PCR擴增，實時熒光定量PCR反應體系為：2.5×SYBR?Green8ul，10μmol/L引物Amy3-F1和Amy3-R1或相應內參引物各2μl，模板1μl，加滅菌超純水至20μl。

10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（3）、（4）、（5）中，實時熒光定量PCR反應擴增程序為：

a、95℃3min，

b、95℃20s，

c、60℃30s，

d、68℃30s，

重復b-d步驟，40個循環；

e、溶解曲線范圍為65-95℃，每0.5℃讀一次數，時間為10s。