[發明專利]一種假儉草總DNA提取方法

有效

• 申請號: 201310358777.0
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103436525A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 王鵬良;楊利平;覃子海;吳幼媚;陳曉明;陳博雯;劉海龍;蔡玲;韋穎文;黃金使;黃宏喜
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區林業科學研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 鄒超賢

技術領域

本發明屬于草業學科中的分子生物學領域，特別涉及一種假儉草總DNA提取方法。

背景技術

假儉草（Eremochloa?ophiuroides(Munro.)Hack.），又稱百足草、蜈蚣草，為禾本科蜈蚣草屬多年生宿根性優良草坪植物，也是蜈蚣草屬中唯一可用作草坪草的物種。假儉草除在東南亞有很少量分布外，在我國長江流域及以南地區的丘陵山地、平原以及各類濕地廣泛分布，是國外公認的起源于中國的最好的暖季型草坪草，所以稱之為“中國草坪草”。該草以耐瘠薄、病蟲害少及養護要求低而著稱，所以國外又稱之為“懶人草”。此外，假儉草有非常好的耐酸性，其耐酸性是禾本科中最強的，可以在江西等強酸性紅壤地區生長繁殖，這在草類物種中也非常少見。假儉草可廣泛用于庭院草坪、休憩草坪及護坡草坪的建植，特別適合于水土保持和大面積景觀建設，是世界三大暖季型草坪草之一。假儉草不僅可以用作草坪草，也是很好的牧草，為牛羊等草食動物喜食。隨著全球水資源和能源的日益緊張以及人們環保意識的不斷增強，選擇質地適中、適應性強及養護要求低的草種已是草坪草品種選育的主要目標，而假儉草非常符合這一發展趨勢。因此，在國內外假儉草越來越廣泛地應用于草坪生產和環境綠化。

總DNA的提取是分子生物學實驗的非常關鍵的一個環節，其質量直接影響分子生物學實驗中與DNA有關的后續實驗的進行。假儉草是一種富含次生代謝物質的一個物種，傳統的DNA提取方法不易提取得到高質量的總DNA。由于次生代謝產物的種類及其復雜，不同物種，同一物種不同季節，不同年齡的葉片之間的次生代謝產物也有較大區別。因此，一種植物的總DNA提取方法往往不能很好的應用于另一種植物總DNA的提取。

發明內容

本發明為了克服現有技術的不足，提供一種可分離出純度高，完整性好的假儉草總DNA提取方法。

本發明是通過以下技術方案得以實現的：

一種假儉草總DNA提取方法，其特征在于：具體操作步驟如下：

（1）稱取0.2g假儉草，置于液氮研磨機中研磨，磨細后的假儉草轉移至2mL的離心管中；

（2）在2ml離心管中加入0.7mL的CTAB提取緩沖液和14μL?β-巰基乙醇，蓋上離心管蓋，混合均勻，在65℃水中溫浴30min，期間顛倒混勻5-6次；

（3）將溫浴后的樣品取出，冷卻至室溫，向2ml離心管中加入0.7mL含有氯仿與異戊醇比例為24:1的混合液，蓋上離心管蓋，上下顛倒充分混勻，置于離心機，在轉速11000rpm離心15min，吸取上層清液，轉移至新的1.5mL離心管中；

（4）在1.5mL離心管中加入150μL硅珠懸浮液，用渦旋震蕩器混勻，室溫靜止10min后，在渦旋震蕩器上渦旋震蕩5s，再置于離心機在轉速8000rpm離心15s，倒出上層清液后，得到下層的硅珠-核酸復合物；

（5）將步驟（4）得到硅珠-核酸復合物置于渦旋震蕩器中進行充分渦旋，使其完全分散，然后加入0.7mL漂洗液，充分混勻，置于離心機在轉速8000rpm離心15s，倒出上層清液后，得到下層的硅珠-核酸復合物；

（6）重復步驟（5）一次；

（7）將步驟（6）得到的硅珠-核酸復合物置于渦旋震蕩器中進行充分渦旋分散，加入1mL70%酒精將硅珠-核酸復合物漂洗兩次，再用無水乙醇漂洗一次后，將硅珠-核酸復合物自然風干；

（8）向裝有步驟（7）得到的硅珠-核酸復合物的離心管中加入100μL?TE緩沖液，并在渦旋震蕩器中進行渦旋震蕩，使之充分分散，在56℃水中溫浴10min后，置于離心機在轉速11000rpm離心5min，吸取上層清液，轉移至新的1.5mL離心管中,得到分離物硅珠和上層清液；

（9）將步驟（8）中得到的硅珠置于渦旋震蕩器中進行渦旋震蕩，使硅珠和殘留的核酸充分分散，再向其加入100μL?TE緩沖液，置于渦旋震蕩器中進行充分渦旋震蕩后，在56℃溫浴10min，置于離心機在轉速12000rpm離心5min，吸取上層清液，裝入步驟（8）中上層清液的1.5ml離心管；將該離心管置于離心機在轉速12000rpm離心10min，吸取上層清液，并加入400μL?TE緩沖液，充分混勻，得到混合液；

（10）向裝有步驟（9）的混合液的離心管中加入600μL含有氯仿與異戊醇比例為24:1的混合液，混勻；置于離心機在轉速12000rpm離心10min；吸取上層清液，轉移至新的1.5mL離心管中；

（11）重復步驟（10）一次；