[發明專利]一種假儉草總DNA提取方法

有效

• 申請號: 201310358777.0
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103436525A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 王鵬良;楊利平;覃子海;吳幼媚;陳曉明;陳博雯;劉海龍;蔡玲;韋穎文;黃金使;黃宏喜
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區林業科學研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 鄒超賢

1.一種假儉草總DNA提取方法，其特征在于：具體操作步驟如下：

（1）稱取0.2g假儉草，置于液氮研磨機中研磨，磨細后的假儉草轉移至2mL的離心管中；

（2）在2ml離心管中加入0.7mL的CTAB提取緩沖液和14μL?β-巰基乙醇，蓋上離心管蓋，混合均勻，在65℃水中溫浴30min，期間顛倒混勻5-6次；

（3）將溫浴后的樣品取出，冷卻至室溫，向2ml離心管中加入0.7mL含有氯仿與異戊醇比例為24:1的混合液，蓋上離心管蓋，上下顛倒充分混勻，置于離心機，在轉速11000rpm離心15min，吸取上層清液，轉移至新的1.5mL離心管中；

（4）在1.5mL離心管中加入150μL?硅珠懸浮液，用渦旋震蕩器混勻，室溫靜止10min后，在渦旋震蕩器上渦旋震蕩5s，再置于離心機在轉速8000rpm離心15s，倒出上層清液后，得到下層的硅珠-核酸復合物；

（5）將步驟（4）得到硅珠-核酸復合物置于渦旋震蕩器中進行充分渦旋，使其完全分散，然后加入0.7mL漂洗液，充分混勻，置于離心機在轉速8000rpm離心15s，倒出上層清液后，得到下層的硅珠-核酸復合物；

（6）重復步驟（5）一次；

（7）將步驟（6）得到的硅珠-核酸復合物置于渦旋震蕩器中進行充分渦旋分散，加入1mL?70%酒精將硅珠-核酸復合物漂洗兩次，再用無水乙醇漂洗一次后，將硅珠-核酸復合物自然風干；

（8）向裝有步驟（7）得到的硅珠-核酸復合物的離心管中加入100μL?TE緩沖液，并在渦旋震蕩器中進行渦旋震蕩，使之充分分散，在56℃水中溫浴10min后，置于離心機在轉速11000rpm離心5min，吸取上層清液，轉移至新的1.5mL離心管中,得到分離物硅珠和上層清液；

（9）將步驟（8）中得到的硅珠置于渦旋震蕩器中進行渦旋震蕩，使硅珠和殘留的核酸充分分散，再向其加入100μL?TE緩沖液，置于渦旋震蕩器中進行充分渦旋震蕩后，在56℃溫浴10min，置于離心機在轉速12000rpm離心5min，吸取上層清液，裝入步驟（8）中上層清液的1.5ml離心管；將該離心管置于離心機在轉速12000rpm離心10min，吸取上層清液，并加入400μL?TE緩沖液，充分混勻，得到混合液；

（10）向裝有步驟（9）的混合液的離心管中加入600μL含有氯仿與異戊醇比例為24:1的混合液，混勻；置于離心機在轉速12000rpm離心10min；吸取上層清液，轉移至新的1.5mL離心管中；

（11）重復步驟（10）一次；

（12）向裝有步驟（11）得到的上層清液的離心管中加入3M,?pH為5.2的60μL?NaAC，再加入600μL在-20℃預冷的異丙醇，置于離心機在轉速10000rpm離心15min；倒掉上層清液，得到下層的DNA；

（13）在步驟（12）中得到的DNA，加入700μL體積濃度70%的酒精洗DNA，置于離心機在轉速10000rpm離心5min，倒掉上層清液，得到下層的DNA；

（14）重復步驟（13）兩次；

（15）向步驟（14）中得到的DNA加入700μL?無水乙醇，進行清洗，置于離心機在轉速10000rpm離心5min，倒掉上層清液，并用黃槍頭吸干酒精，得到純化DNA；

（16）將步驟（15）得到的純化DNA置于室溫自然風干，然后向其加入200μL?TE緩沖液溶解，保存在-20℃冰箱中。

2.根據權利要求1所述的一種假儉草總DNA提取方法，其特征在于：所述的CTAB提取緩沖液成分為：2%CTAB,?10mM?Tris-HCl,?8mM?EDTA,?1.4M?NaCl,?5%PVP,?pH值為8.0。

3.根據權利要求1所述的一種假儉草總DNA提取方法，其特征在于：所述的TE溶液成分為：10mM?Tris-HCl,?1mM?EDTA,?pH?8.0。

4.根據權利要求1所述的一種假儉草總DNA提取方法，其特征在于：所述的硅珠懸浮液是將1.2g硅珠粉加入10mL已滅菌的超純水中，混合均勻而成。

5.根據權利要求1所述的一種假儉草總DNA提取方法，其特征在于：所述的漂洗液是100mL的pH為?6.4的100mM/L?Tris-HCl溶解120g異硫氰酸胍(?GuSCN?)所得漂洗液。

6.根據權利要求1所述的一種假儉草總DNA提取方法，其特征在于：步驟（4）所述的上層清液用硅珠懸浮液按步驟（4）用來進行多次提取硅珠-核酸復合物。