[發明專利]一種高效重組表達透明質酸酶的方法

無效

• 申請號: 201310358573.7
• 申請日: 2013-08-15
• 公開（公告）號: CN103436508A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;康振;金鵬
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種高效重組表達透明質酸酶的方法，具體地是在透明質酸酶基因N端添加一段寡聚核苷酸序列以顯著提高透明質酸酶表達產量，屬于基因工程技術領域。

背景技術

透明質酸酶(hyaluronidase,HAase)主要專一性水解透明質酸，廣泛存在于真核和原核生物中，在動物機體內參與許多重要的生物學過程，例如細胞分裂、細胞間的連接、生殖細胞的活動、DNA的轉染、胚胎發育、受傷組織的修復，以及正常細胞和腫瘤細胞增生，是一種重要的生理活性物質。且于1928年被Duran?Reynals首次發現并稱為“擴散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名為透明質酸酶。根據透明質酸酶作用的底物特異性和催化機制，水蛭透明質酸酶屬于透明質酸3-糖基水解酶家族(EC3.2.1.36)，通過水解HA的β-1、3-糖苷鍵，生產以四糖分子HA且還原端帶有葡萄糖醛酸為主的產物。水蛭來源的透明質酸酶對底物的專一性強，與其它來源的透明質酸酶相比，它對硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素不具有活性，并且不具有轉糖苷活性，活性不受肝素影響。因此，水蛭透明質酸酶用于臨床藥用更具醫療價值意義。1941年Hirst首次證實水蛭透明質酸酶強有力的抗菌性。相關研究實驗已經證實透明質酸酶對治療心肌梗塞效果顯著。透明質酸酶在抗腫瘤方面也具有重要的作用，惡性組織經透明質酸酶處理后粘多糖含量增加，有利于腫瘤細胞結合更多的抗癌藥物。此外，透明質酸酶在臨床上作為“藥物擴散因子”、治療血栓、青光眼和其它藥用方面具有更大的應用價值。

目前，水蛭來源的透明質酸酶基因尚未有相關報道。當前水蛭來源的透明質酸酶是以活體水蛭組織提取為主獲得，且每個水蛭提取所獲得透明質酸酶僅約為230U。本發明采用畢赤酵母重組生產透明質酸酶具有無法比擬的優勢，突破了水蛭原料來源的限制和提取分離步驟的繁瑣等因素的限制，能夠推動透明質酸酶在醫療和科研上的廣泛應用。

外源蛋白在宿主中的活性表達與產量是構建工程菌最重要的兩個指標，本發明在已獲得水蛭透明質酸酶在畢赤酵母中活性分泌表達的基礎上，通過人為在N端添加一段寡聚核苷酸序列，顯著提高了透明質酸酶的表達產量。在N端添加的一段序列，對于mRNA的轉錄、穩定性和后翻譯修飾，以及信號肽的后加工成熟分泌都有重要影響。而這些因素也顯著影響著外源蛋白在宿主菌中的正確折疊、后加工修飾和順利分泌。

鑒于此，本發明中構建的新型重組工程菌顯著提高了重組透明質酸酶的產量，該方法將有利于進一步降低工業化生產水蛭透明質酸酶的成本，更有利于水蛭透明質酸酶的醫療藥用和科研范圍的擴大。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題是提供一種高效重組表達透明質酸酶的方法，是在透明質酸酶基因N端添加一段寡聚核苷酸序列，構建透明質酸酶產量顯著提高的基因工程菌。

所述在透明質酸酶基因N端添加的一段寡聚核苷酸序列，其核苷酸序列如(a)或(b)所示：

（a）如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列；

（b）與（a）中的序列具有類似功能，添加至透明質酸酶基因N端不引起翻譯移碼，能活性表達透明質酸酶并提高重組透明質酸酶表達量和/或酶活。

所述透明質酸酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；在其N端添加SEQ?ID?NO.1所述序列后所得重組透明質酸酶基因的序列如SEQ?ID?NO.3所示。

具體地，是在透明質酸酶基因HaseA3887（SEQ?ID?NO.2）的N端添加一段核苷酸，構建重組質粒pPIC9K-His-HaseA3887，轉化畢赤酵母P.pastoris?GS115進行表達。包括以下步驟：基于透明質酸酶基因HaseA3887，合成引物時，在上游引物BYA3887HF引入限制性酶切位點EcoRI和18個核苷酸（6×his-tag序列），下游引物BYA3887R引入NotI酶切位點；構建的重組質粒pPIC9K-His-HaseA3887經SalI線性化后電轉入P.pastoris?GS115中并確認HaseA3887基因重組P.pastoris?GS115成功。

所述上游引物BYA3887HF:5’-CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC-3’；下游引物BYA3887R:5’-TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC-3’。