[發明專利]一種高效重組表達透明質酸酶的方法

無效

• 申請號: 201310358573.7
• 申請日: 2013-08-15
• 公開（公告）號: CN103436508A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;康振;金鵬
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種高效重組表達透明質酸酶的方法，是在透明質酸酶基因N端添加一段核苷酸，構建基因工程菌進行表達；所述添加的核苷酸序列為如下（a）或（b）所示的序列：

（a）SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，

（b）與（a）中的序列具有類似功能，添加至透明質酸酶基因N端不引起翻譯移碼，能活性表達透明質酸酶并提高重組透明質酸酶表達量和/或酶活。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，是在SEQ?ID?NO.2所示的透明質酸酶基因的N端添加一段SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸，構建重組質粒pPIC9K-His-HaseA3887，轉化畢赤酵母P.pastoris?GS115進行表達。

3.根據權利要求1所述方法獲得的重組載體。

4.根據權利要求3所述的重組載體，其特征在于，優選含有重組透明質酸酶基因的pPIC9K。

5.根據權利要求1所述方法獲得的基因工程菌。

6.根據權利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，優選含有重組透明質酸酶基因的畢赤酵母P.pastoris?GS115。

7.應用權利要求6所述基因工程菌高效表達透明質酸酶的方法，其特征在于將種子培養液按10%的接種量接種到含25mL?BMGY培養基的容量為250mL的搖瓶中，溫度為30℃、pH為6.0培養至OD₆₀₀為4，離心收集菌體接種至誘導表達培養基BMMY，每隔24h補加1%甲醇，誘導表達96h；將發酵液經親和層析純化得到透明質酸酶蛋白。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，透明質酸酶的純化條件為：采用葡聚糖鎳進行親和層析純化透明質酸酶蛋白，分別用0、10、20、30、40、50mM的咪唑洗脫雜質，再以500mM的咪唑緩沖液特異性洗脫目標蛋白，再進行梯度透析獲得純透明質酸酶蛋白。