[發(fā)明專利]一種用傳代細(xì)胞源生產(chǎn)豬偽狂犬病活疫苗的方法及其制品

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310355677.2
• 申請(qǐng)日: 2013-08-15
• 公開（公告）號(hào): CN104367996B
• 公開（公告）日: 2017-09-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?jiān)S科;孫進(jìn)忠;田克恭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/245
• 分類號(hào): A61K39/245;A61P31/22;C12N7/00
• 代理公司: 北京華夏正合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11017
• 代理人: 韓登營

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，更具體是涉及一種用傳代細(xì)胞源生產(chǎn)豬偽狂犬病活疫苗的方法及其制品。

背景技術(shù)

偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（PRV）引起多種動(dòng)物的一種急性傳染病。該傳染病遍布世界上主要養(yǎng)豬國家。免疫接種是防治豬偽狂犬病的主要策略。我國目前生產(chǎn)豬偽狂犬病活疫苗所用的細(xì)胞為雞胚成纖維原代細(xì)胞，造成批間差異較大，產(chǎn)毒滴度不高，給疫苗產(chǎn)量、效力的提高帶來了困難，而且細(xì)胞碎片與雜蛋白多，易引起過敏反應(yīng)。并且半成品病毒液的存放需要在-15℃以下保存，以免造成病毒效價(jià)的降低。

目前活疫苗常用的保護(hù)劑為明膠、蔗糖、脫脂牛奶、胰蛋白胨、EDTA、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等，組分復(fù)雜，各成分比例較難搭配，以致保護(hù)性能差。如果在2℃～8℃條件下，保存期只有3～6個(gè)月，多需要在-15℃以下保存。而國內(nèi)傳統(tǒng)的動(dòng)物用疫苗保護(hù)劑的研制相對(duì)滯后，使疫苗的長期保存和長途運(yùn)輸受到很大限制，加上基層防疫部門缺乏必要的冷凍和冷藏設(shè)施，容易因免疫失敗而造成疫病流行。當(dāng)前，我國偽狂犬活疫苗存放溫度仍然是-15℃以下，所以耐熱保護(hù)劑的研究非常急需。

現(xiàn)有凍干活疫苗在使用時(shí)用稀釋液進(jìn)行稀釋時(shí)，一般是在常溫下進(jìn)行，需要在較短時(shí)間進(jìn)行免疫注射，避免病毒效價(jià)下降，進(jìn)而造成免疫失敗。現(xiàn)有豬偽狂犬病活疫苗通常是用生理鹽水進(jìn)行稀釋，稀釋后在30分鐘、10分鐘甚至更短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行免疫。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種用傳代細(xì)胞源生產(chǎn)豬偽狂犬病活疫苗的方法及豬偽狂犬病活疫苗產(chǎn)品。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種用傳代細(xì)胞源生產(chǎn)豬偽狂犬病活疫苗的方法。該方法包括如下步驟：

（1）用傳代細(xì)胞培養(yǎng)豬偽狂犬病病毒弱毒株；

（2）收獲病毒液；

（3）加穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真空干燥得到傳代細(xì)胞源豬偽狂犬病活疫苗。

優(yōu)選的，所述步驟（1）包括如下步驟：

（1a）制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)：所述傳代細(xì)胞經(jīng)胰酶細(xì)胞分散消化傳代，用細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成傳代細(xì)胞單層；

（1b）細(xì)胞毒種的繁殖：將所述豬偽狂犬病病毒弱毒株接種至所述步驟（1a）中得到的傳代細(xì)胞單層，用細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；24h～44h后收獲細(xì)胞培養(yǎng)病毒液作為生產(chǎn)用毒種；

（1c）制苗毒液的繁殖：取所述步驟（1a）中得到的傳代細(xì)胞單層，棄去所述細(xì)胞生長液，接種所述步驟（1b）中得到的生產(chǎn)用毒種，繼續(xù)培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述步驟（1a）、（1b）、（1c）中的細(xì)胞培養(yǎng)所用的溫度為36℃～38℃。

優(yōu)選的，所述步驟（1b）、（1c）中豬偽狂犬病病毒弱毒株接種時(shí)的接種量為1%～2%體積百分比的生產(chǎn)用細(xì)胞毒種的維持液。

優(yōu)選的，所述步驟（1a）中的細(xì)胞生長液含90%～97%體積百分比的細(xì)胞培養(yǎng)液和3%～10%體積比的牛血清，所述細(xì)胞生長液的pH值為7.0～8.0。

優(yōu)選的，所述步驟（1b）、（1c）中的細(xì)胞維持液含95%～99%體積百分比的細(xì)胞培養(yǎng)液和1%～5%體積比的牛血清，所述細(xì)胞維持液的pH值為7.1～7.5。

其中所述的適合培養(yǎng)易增殖豬偽狂犬病毒的傳代細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液包括但不限于選自MEM培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、EMEM培養(yǎng)液、199培養(yǎng)液、1640培養(yǎng)液和α-MEM培養(yǎng)液中的任意一種，所述的牛血清包括但不限于胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。

優(yōu)選的，所述的細(xì)胞培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)液，所述的牛血清為胎牛血清。

優(yōu)選的，所述步驟（2）包括如下步驟：接毒后24h～44h收獲細(xì)胞培養(yǎng)毒液，收獲的毒液置于0℃以上保存。

更優(yōu)選的，所述收獲的毒液置于2℃～8℃條件下保存。