[發(fā)明專利]孔雀石綠人工抗原和抗體及其制備方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310352708.9
• 申請日: 2013-08-14
• 公開（公告）號: CN103524362A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設計）人: 胡章立
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C07C227/10
• 分類號: C07C227/10;C07C229/52;C07C229/42;C07K14/77;C07K14/795;C07K16/06;G01N33/53
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 康宇寧

1.一種孔雀石綠半抗原，其特征在于：所述的半抗原包括（a）4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸，和(b)5-{4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸，其中，（a）4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸的結構如下：

(b)?5-{4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸的結構如下：

。

2.權利要求1所述的孔雀石綠半抗原與載體蛋白連接形成的完全抗原，其特征在于：以4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸和5-{4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸為半抗原，分別與卵清蛋白或血藍蛋白偶聯(lián)，其結構如下：

???，

???，?。

3.權利要求1所述的4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸的合成方法如下，其特征在于，包括如下步驟：?稱取對-甲酰基苯甲酸甲酯和氯化鋅于燒瓶中，然后加入N,N-二甲基苯胺，加熱到120-140℃，攪拌反應4-6小時，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯/正己烷?=?1:2的硅膠柱層析純化18-24h后，得到目標化合物4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸。

4.權利要求1所述的5-{4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸的合成方法如下，其特征在于，包括如下步驟：?

稱取對-羥基苯甲酸溶于二氯甲烷中，0℃加入溴化芐及三乙胺，室溫攪拌反應1-2天，0℃加入飽和氯化銨淬滅反應，二氯甲烷萃取，濃縮，硅膠柱純化（乙酸乙酯/正己烷=?1:3）得到化合物4-羥甲基苯甲酸苯甲酯；

將該產(chǎn)物溶于二氯甲烷中，0℃加入三氯異氰尿酸、NaHCO₃及2,2,6，6-四甲基哌啶氧化物，反應5-8分鐘，硅膠柱純化（乙酸乙酯/正己烷=?1:2），洗脫液濃縮得到化合物4-甲酰基苯甲酸苯甲酯；

稱取wittig試劑溶于四氫呋喃中，慢慢加入六甲基二硅基胺基鋰，在-80--75℃攪拌0.5-2.0小時，加入4-甲酰基苯甲酸苯甲酯，兩小時內(nèi)溫度由-80--75℃升到-25℃，TLC監(jiān)測，濃縮，硅膠柱純化（乙酸乙酯/正己烷=?1:4）得到中間產(chǎn)物；將中間產(chǎn)物溶于無水甲醇，加入鈀碳，氫氣保護，常溫攪拌反應4-6小時，TLC監(jiān)測，加入少量乙酸乙酯，硅膠柱純化（甲醇），濃縮得化合物4-丁酸乙酯基苯甲酸；

將上述產(chǎn)物溶于無水四氫呋喃，0-4℃加入氯甲酸異丁酯及三乙胺，攪拌反應1-2小時，加入硼氫化鈉，繼續(xù)攪拌反應3-5小時，0-4℃加入HCl淬滅反應，濃縮，乙酸乙酯萃取，濃縮，硅膠柱純化（乙酸乙酯/正己烷?=?1:5）得到化合物5-(4-羥甲基-苯基)-戊酸乙酯；

將該化合物溶于二氯甲烷中，0-4℃加入三氯異氰尿酸、NaHCO₃及2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物，反應5-8分鐘后迅速過硅膠短柱（乙酸乙酯/正己烷=?1:4），得到化合物5-(4-羥基-苯基)-戊酸乙酯；

稱取氯化鋅和化合物5-(4-羥基-苯基)-戊酸乙酯于燒杯中，加入N,N-二甲基苯胺，加熱到110-130℃，攪拌反應1-2天，TLC監(jiān)測，乙酸乙酯萃取，硅膠柱純化（甲醇/二氯甲烷=?1:10），得目標化合物5-{4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸，產(chǎn)率25%。

5.權利要求2所述的完全抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

取權利要求1所述半抗原以及N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）于燒瓶內(nèi)加入無水四氫呋喃，在N₂保護下，逐滴加入溶有N,?N-二環(huán)己基碳二亞胺DCC的無水四氫呋喃溶液，邊滴邊攪拌?，室溫（18-25℃）下攪拌反應4-6?h，硅膠柱純化得到半抗原活化酯；

取權利要求1所述半抗原的活化酯溶于DMF配成溶液A，載體蛋白溶于磷酸緩沖溶液中配成溶液B，然后在冰浴下將溶液A緩慢加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在4℃下反應過夜，最后將反應液置入透析袋中，在4℃?，ph=7.4的PBS溶液中透析三天，精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積，測定濃度和結合比，分裝，-20℃下貯藏。