[發(fā)明專利]孔雀石綠人工抗原和抗體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310352708.9
• 申請日: 2013-08-14
• 公開（公告）號: CN103524362A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡章立
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳大學(xué)
• 主分類號: C07C227/10
• 分類號: C07C227/10;C07C229/52;C07C229/42;C07K14/77;C07K14/795;C07K16/06;G01N33/53
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 康宇寧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明申請涉及具有三苯甲烷類結(jié)構(gòu)的孔雀石綠人工半抗原、特異性抗原的合成及特異性抗體的制備，屬于小分子化合物免疫化學(xué)和殘留分析技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

隨著國民經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，城鄉(xiāng)居民生活水平不斷提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)正發(fā)生深刻的變化。水產(chǎn)品以其低脂肪、低膽固醇、高蛋白、營養(yǎng)豐富、味道鮮美等優(yōu)點(diǎn)，正成為廣大消費(fèi)者所青睞的食品之一。?

與其它肉類產(chǎn)品相比，微生物更易于在水產(chǎn)品體內(nèi)繁殖，在水產(chǎn)品的腸道、皮膚、肌肉中我們很容易發(fā)現(xiàn)各種致病菌、病毒和寄生蟲，養(yǎng)殖戶為了預(yù)防和防治水產(chǎn)動物患病或受微生物污染，在養(yǎng)殖過程中會使用殺蟲劑、殺菌劑等，這些藥物的違規(guī)使用或不合理使用又會引發(fā)藥物殘留等質(zhì)量安全問題。因此，加快水產(chǎn)品安全快速檢測技術(shù)研究，提高水產(chǎn)品質(zhì)量，建立健全水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督體系，對提高我國水產(chǎn)品在全球市場的競爭力，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和深遠(yuǎn)的戰(zhàn)略意義。?

孔雀石綠是人工合成的有機(jī)化合物，其是由1摩爾分子的苯甲醛（Benzaldehyde）和2摩爾分子的二甲苯胺在濃鹽酸混和下，加熱縮合成隱色素堿（Leuco?base），在酸性條件下加過氧化鉛使其氧化，并在堿性液中沉淀出色素堿，它屬于三苯甲烷型的綠色染料?？兹甘G以往僅在制陶業(yè)、紡織業(yè)、皮革業(yè)、食品著色劑等方面有所使用。自1933年起孔雀石綠開始作為驅(qū)蟲劑、殺菌劑、防腐劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中出現(xiàn)，而后因?yàn)槠渚哂袃r(jià)格低廉、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于預(yù)防與治療各類水產(chǎn)動物的水霉病和對原蟲的控制。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)孔雀石綠進(jìn)入生物機(jī)體后可影響其生長和繁殖能力，造成肝、脾、腎和心臟的病變，對皮膚、眼睛及肺部都有一定的損傷，還具有致癌、致畸和致突變等副作用。鑒于孔雀石綠的危害性，國內(nèi)外對其殘留量制定了嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，包括美國、加拿大和歐盟在內(nèi)的許多國家都規(guī)定，不能在水產(chǎn)品中使用孔雀石綠。歐盟確定孔雀石綠和隱色孔雀石綠的最低執(zhí)法限量為2ug/kg;?加拿大水產(chǎn)品養(yǎng)殖全程禁止使用孔雀石綠，并規(guī)定了魚產(chǎn)品中孔雀石綠和無色孔雀石綠含量須在1ppb以下，2002年12月農(nóng)業(yè)部對農(nóng)牧發(fā)[1999]17號文《動物性食品中獸藥殘留限量》進(jìn)行了重新修訂(235號公告)中規(guī)定孔雀石綠為不得檢出。日本于2006年實(shí)施的《肯定列表制度》，其中規(guī)定孔雀石綠不得檢出。但由于孔雀石綠的抗菌效果較好，價(jià)格便宜，不少水產(chǎn)養(yǎng)殖戶仍偷偷使用，因此對孔雀石綠的殘留監(jiān)控工作依然是一項(xiàng)艱巨而重大的任務(wù)。?

目前孔雀石綠及隱孔雀石綠殘留檢測主要是氣相色譜法和高效液相色譜法，儀器檢測法雖然準(zhǔn)確率較高，但因其設(shè)備昂貴，操作繁瑣，不適用于現(xiàn)場快速檢測。因而迫切需要開發(fā)一種簡便、快速、靈敏的檢測孔雀石綠殘留的方法。?

酶聯(lián)免疫吸附分析，即ELISA法，利用了抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用，即保持了抗原抗體的特異性，又保持了酶催化反應(yīng)的敏感性，因而極大的提高了反應(yīng)靈敏度。同時(shí)它又屬于一種非均相免疫分析，即在反應(yīng)中的每一步都通過洗滌除去了未反應(yīng)物質(zhì)和干擾物質(zhì)。利用?ELISA方法不僅可以定性而且可以定量檢測樣品中的微量殘留物，這種分析方法對儀器設(shè)備要求不高，具有簡便快速，靈敏度高，特異性強(qiáng)，易于標(biāo)準(zhǔn)化、自動化和適于大容量樣本分析等優(yōu)點(diǎn)。20?世紀(jì)?80?年代后，免疫分析技術(shù)已成為優(yōu)先研究、開發(fā)和利用的獸藥殘留快速檢測技術(shù)，美國化學(xué)學(xué)會已經(jīng)將免疫分析方法與?GC?、?HPLC?方法一起列為化學(xué)獸藥殘留分析的三大支柱技術(shù)，這也為食品中微量孔雀石綠殘留檢測提供了新的技術(shù)。?

半抗原是指能與對應(yīng)抗體結(jié)合可以發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)、又不能單獨(dú)激發(fā)人或動物體產(chǎn)生抗體的抗原，即它只有反應(yīng)原性，不具有免疫原性，故又稱作不完全抗原。通常，具有免疫原性的物質(zhì)分子量應(yīng)大于10000，而一般獸藥的分子量均小于1000，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對獸藥抗原決定簇的特異性抗體，因此小分子物質(zhì)必須與大分子載體偶聯(lián)后才具有免疫原性，這也是小分子免疫分析的基本模式。半抗原的結(jié)構(gòu)直接影響了抗體的選擇性，半抗原分子的設(shè)計(jì)與合成是小分子免疫分析技術(shù)的關(guān)鍵所在。半抗原分子的設(shè)計(jì)應(yīng)以獸藥親體以及有毒理學(xué)意義的代謝產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)為目標(biāo)化合物，設(shè)計(jì)中應(yīng)相應(yīng)地突出特定獸藥的分子結(jié)構(gòu)，制備相應(yīng)的單一特異性抗體或族特異性抗體。一般理想的半抗原分子應(yīng)盡量具備與待測物類似的立體化學(xué)特征，以減少免疫交叉反應(yīng)性，提高抗體的特異性；同時(shí)，要保證半抗原與載體的大分子偶聯(lián)后，半抗原的特征結(jié)構(gòu)能最大限度地被免疫活性細(xì)胞所識別，以制備出具有預(yù)期選擇性和高親和力的抗體。?