[發明專利]同時快速準確檢測食品中活的產嘔吐毒素和不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310352410.8
• 申請日: 2013-08-13
• 公開（公告）號: CN103725771A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 李林;楊曉慧;許恒毅;徐波
• 申請（專利權）人: 無錫中德伯爾生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

技術領域

本發明屬于微生物檢測領域，尤其涉及一種快速同時檢測食品中產嘔吐毒素和不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌活菌的方法。?

技術背景

蠟樣芽孢桿菌是一種能產芽孢的革蘭氏陽性菌，廣泛分布于空氣、污水和各類生熟食品中。目前，從多種食品中分離出該菌，包括炒米飯、肉類、乳類和魚等，是常見的食源性致病菌，極有可能危害人們的健康。在我國蠟樣芽孢桿菌引起的中毒事件比較嚴重，在1993～2003十年間，蠟樣芽孢桿菌中毒者高達1758人。蠟樣芽孢桿菌引起的中毒癥狀主要有嘔吐和腹瀉，由腸毒素引起腹瀉的食源性疾病研究較多，檢測方法比較成熟并已經商業化，然而關于蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素的研究相對較少，但是嘔吐型蠟樣芽孢桿菌引發的食物中毒，尤其是米飯類的中毒事件時有發生。在美國，食用炒米飯發生中毒的主要原因是其中污染了產嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌。目前，蠟樣芽孢桿菌已被挪威和荷蘭認定為食品中最容易檢出的病源微生物。蠟樣芽孢桿菌主要造成食物和飲水不衛生的人群中毒，其中使用受污染的食物是造成蠟樣芽孢桿菌感染的主要途徑。?

目前檢測蠟樣芽孢桿菌的方法主要是通過傳統的培養方法。傳統?方法具有勞動強度高、耗時、費用高等缺點，且特異性差，易造成大量錯誤識別。因此快速、準確地檢測蠟樣芽孢桿菌的方法至關重要。?

蠟樣芽孢桿菌的cesB是嘔吐毒素合成酶結構基因的一個亞基，能夠編碼蠟樣芽孢桿菌的嘔吐毒素。本發明采用cesB作為靶基因設計引物進行檢測，特異性強，能用于對蠟樣芽孢桿菌進行準確檢測。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種能消除假陰性和假陽性且能同時檢測產嘔吐毒素和不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的方法。該方法可用于食品樣本中活的產嘔吐毒素和不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的初篩檢測，其操作快速、結果客觀準確，避免了現有方法操作繁瑣、費時費力和成本高昂的缺點。?

本發明是通過以下技術方案實現的。?

一種同時快速準確檢測食品中活的產嘔吐毒素和不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的試劑盒，其特征在于含有引物分別為：從5’-3’為?

cesB-F:ACCCATCTTGCGTCATT?

cesB-R:CAGCCAAGTGAAGAATACC?

16S-F:GCGGCGTGCCTAATACATGC?

16S-R:CTCAGGTCGGCTACGCATCG?

IAC-F:CCTACGGGAGGCAGCAGT?

IAC-R:CGTTTACGGCGTGGACTAC。?

所述的試劑盒還含有疊氮溴化丙錠PMA，PBS磷酸鹽緩沖液，Taq?mix。?

本發明涉及一種疊氮溴化丙錠處理結合多重PCR快速同時檢測食品中活的產嘔吐毒素和不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌試劑盒的檢測方法，包括如下步驟：?

（1）取食物樣本，按質量體積比1:9加PBS緩沖液，充分混勻，離心，取上清得菌懸液；?

（2）取制備好的菌懸液加疊氮溴化丙錠溶液，使PMA的終質量濃度為5μg/mL，混勻后室溫避光培養，鹵素燈曝光，光照交聯時樣品置于冰上，交聯后的懸浮液離心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA；?

（3）所得DNA進行mPCR，體系包含總共20μL反應液，其中，3μL制備的模板DNA溶液，10μL2×Taq?mix，cesB引物的濃度是0.4μM，16S?rRNA引物的濃度是0.1μM，擴增內標的濃度為0.25μM；反應條件是：95℃10min，接著40個循環（94℃30s，51℃30s，72℃30s），最后72℃延伸10min；?

（4）mPCR反應結束后，進行目的菌檢測分析。?

步驟（1）所述的緩沖液為PBS磷酸鹽緩沖液。?

步驟（3）所述引物分別為：從5’-3’為?

cesB-F:ACCCATCTTGCGTCATT?

cesB-R:CAGCCAAGTGAAGAATACC?

16S-F:GCGGCGTGCCTAATACATGC?

16S-R:CTCAGGTCGGCTACGCATCG?

IAC-F:CCTACGGGAGGCAGCAGT?

IAC-R:CGTTTACGGCGTGGACTAC?