[發明專利]同時快速準確檢測食品中活的產嘔吐毒素和不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310352410.8
• 申請日: 2013-08-13
• 公開（公告）號: CN103725771A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 李林;楊曉慧;許恒毅;徐波
• 申請（專利權）人: 無錫中德伯爾生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

1.一種同時快速準確檢測食品中活的產嘔吐毒素和不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的試劑盒，其特征在于含有引物分別為：從5’-3’為

cesB-F:?ACCCATCTTGCGTCATT

cesB-R:?CAGCCAAGTGAAGAATACC

16S-F:?GCGGCGTGCCTAATACATGC

16S-R:?CTCAGGTCGGCTACGCATCG

IAC-F:?CCTACGGGAGGCAGCAGT

IAC-R:?CGTTTACGGCGTGGACTAC?。

2.根據權利要求1所述的一種同時快速準確檢測食品中活的產嘔吐毒素和不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的試劑盒，其特征在于還含有疊氮溴化丙錠PMA，PBS磷酸鹽緩沖液，Taqmix。

3.根據權利要求1或2所述的一種同時快速準確檢測食品中活的產嘔吐毒素和不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌試劑盒的檢測方法，其特征在于包含下列步驟：

（1）取食物樣本，以按質量體積比1:?9加無菌緩沖液，充分混勻，離心，取上清得菌懸液；

（2）取制備好的菌懸液加疊氮溴化丙錠溶液，使疊氮溴化丙錠PMA的終質量濃度為5?μg/mL，混勻后室溫避光5?min，每隔30?s搖勻一次，曝光，光照交聯時樣品置于冰上，交聯后的懸浮液離心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA；

（3）所得DNA進行mPCR，體系包含總共20?μL反應液，其中，3?μL?制備的模板DNA溶液，10?μL?2?×?Taqmix，cesB引物的濃度是0.4?μM，16S?rRNA引物的濃度是0.1?μM，擴增內標的濃度為0.25?μM;反應條件是：95?℃?10?min，接著40個循環（94℃?30?s，?51℃?30?s，72℃?30?s），最后?72℃?延伸10?min；

（4）mPCR?反應結束后，進行目的菌檢測分析。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于步驟（1）所述的緩沖液為PBS磷酸鹽緩沖液。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4）所述目的菌檢測分析為用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，若有475?bp條帶，則指示反應體系正常；若沒有出現475?bp條帶，則反應體系有PCR抑制劑或者PCR操作出現錯誤，需要重新進行PCR；

擴增產物有475?bp條帶的前提下，若有267?bp條帶和154?bp條帶，則說明有產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌；若僅有267?bp條帶，則說明有不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌。