[發明專利]一種快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法

無效

• 申請號: 201310351330.0
• 申請日: 2013-08-13
• 公開（公告）號: CN103525908A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 黃明;程欣;楊靜;黃繼超;周興虎
• 申請（專利權）人: 南京吉泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術領域

本發明屬于食品安全檢測領域，涉及的是食品中動物源性成分的快速檢測，具體涉及血旺中鴨、豬、雞三種動物血液成分多重TaqMan探針實時熒光PCR快速檢測方法。

背景技術

近年來，食品的質量安全問題尤其是摻假問題已經越來越受到社會和監管部門的關注。不明成分的食品或虛假食品標簽不僅會導致制造商之間不正當的商業競爭，還有可能危害到消費者的身體健康，不明成分的食品對于敏感人群來說更是潛在的過敏原。在中國、日本和歐洲的一些國家，動物的血液已經作為營養添加劑廣泛用于血腸、布丁和沙拉等食品中。血旺又稱血豆腐，是在動物血液中加鹽待凝固后煮制或不煮制形成的塊狀物。豬、鴨、雞等畜禽血液是制作血旺的主要原料。我國的傳統血旺因其具有很高的營養價值深受消費者喜愛，南京的鴨血粉絲湯作為南京特產聞名遐邇，然而，在經濟利益的驅使下，一些不法分子為牟取暴利而摻雜使假，接連被媒體曝光的假鴨血、毒血旺等事件讓消費者對此類產品望而生畏。目前市場上銷售的血旺均是零散銷售，大多是小作坊加工制造，并且沒有食品標簽，其動物源成分不明，因此，對于鑒別血旺中較常出現鴨血、豬血和雞血，建立科學、準確快速的檢測方法十分必要。

日常生活中人們通常依靠感官和經驗鑒別血旺種類，但是隨著加工方法的改進，這種方法已經不能滿足鑒別需要，尤其是那些摻有兩種或三種不同動物血液的血旺。隨著現代分子生物學的發展，逐步形成了分別以蛋白質檢測與核酸檢測為基礎的方法體系。基于蛋白質的檢測技術，如高效液相色譜法和酶聯免疫分析法，在鑒別加工過的食品時受蛋白質降解的影響，其靈敏度較低，消耗時間長。近幾年來，DNA因其高穩定性和在不同組織中的同一性被選作比蛋白質更可靠的分析靶點，根據不同物種基因序列的特異位點設計特異性引物，利用PCR反應實現特異性基因片段的擴增，繼而通過電泳檢測鑒別食品中動物源性成分的PCR方法已基本取代以蛋白檢測為基礎的鑒別技術。尤其是近5年出現的實時熒光PCR技術，以其高特異性、高靈敏性、無污染和可定量等優點，越來越多的應用于食品中的肉類鑒別。實時熒光PCR是利用PCR反應體系中熒光信號的變化對產物生成進行實時監測的技術，它不僅省去了凝膠電泳的繁瑣操作，減少了假陽性的發生率，還可以避免實驗過程中溴化乙錠對人體的潛在危害。在目標基因選擇方面，線粒體DNA拷貝數多，但是因其在不同組織中含量不同而難以進行定量分析，而動物細胞核基因組DNA序列具有高度的物種特異性，能夠避免非特異性擴增，更加適合用作多重PCR分析；此外，在方法的選擇上，單一PCR的重復性較差且不能實現多個物種的同時鑒定，多重PCR方法則可以同時鑒別多種動物源性成分，大大提高檢測效率和結果的準確性。目前國際上以細胞核基因DNA序列為目標基因，用于鑒別血旺中動物血液成分的多重熒光定量PCR檢測方法尚未見報道。因此，建立用于鑒別血旺中動物血液成分的快速檢測方法將對食品安全的監管具有重要的實踐意義。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法，使其具有準確穩定、操作方便、高效率等特點，滿足使用需求。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法，以血旺為材料，提取DNA，使用TaqMan探針和特異性引物，進行熒光定量PCR反應；應用ABI?7500?Software?SDS1.4對實驗結果進行分析處理，以Ct值小于36的擴增作為檢測的陽性結果；其中，TaqMan探針和特異性引物具體如下：

正向引物1：5’-GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3’，

反向引物1：5’-GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3’，

TaqMan探針1：FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT-BHQ1

正向引物2：5’-CGAGAGGCTGCCGTAAAGG-3’，

反向引物2：5’-TGCAAGGAACACGGCTAAGTG-3’，

TaqMan探針2：CY5-ACAGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGA-BHQ1；

正向引物3：5’-CAGCTGGCCTGCCGG-3’，

反向引物3：5’-CCCAGTGGAATGTGGTATTCA-3’，

TaqMan探針3：HEX-CTGCCAAGCTCTGCCACTCCTCTG-BHQ1。