[發明專利]一株產果膠酶制劑的日本曲霉（Aspergillusjaponicus）PJ01及產酶方法

有效

• 申請號: 201310350534.2
• 申請日: 2013-08-13
• 公開（公告）號: CN103468582A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 單楊;夏金蘭;李培駿;高奇瑞;張闖;聶珍媛;李高陽;付復華
• 申請（專利權）人: 湖南省農產品加工研究所;中南大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N9/88;C12R1/66
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明涉及產果膠酶制劑的菌株及提高其酶活的產酶方法，具體涉及一株利用桔皮粉發酵產果膠酶制劑的菌株及利用表面活性劑提高其酶活的產酶方法。?

背景技術

柑橘加工過程中，會產生大量的果汁、精油和其他副產物，其中橘皮是一種主要的固體副產物，大約占果實鮮重的50%，與此同時，新鮮橘皮被加工廠當做垃圾廢棄而對環境造成很大壓力。以中國為例，全國每年產生皮渣在500萬t以上,僅湖南省柑橘皮渣產量高達65萬t。因此如何利用這些“垃圾”，開發成系列高附加值產品迫在眉睫。?

橘皮的化學成分中果膠16.0%，纖維素22.5%，半纖維素6.0%，木質素8.6%，因此可以作為微生物降解產酶制劑的優良底物，制備的富含果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶的酶制劑。可以用于果汁提取及澄清，植物韌皮組織的脫膠，提取柑橘皮中的檸檬油，提高紅酒的色度和穩定性，動物飼料等領域。另外，可用于生物酶法脫除柑橘囊衣，生物酶法脫囊衣是一種生產效率高、產品質量穩定、安全性高、不污染環境的柑橘罐頭脫囊衣新技術。?

近年來，單菌或混菌發酵產復合多酶（enzyme?cocktail）的研究受到越來越多的關注。對于碳源選擇，Olsson、Botella等人發現霉菌發酵木質素碳源、葡萄皮渣和玉米芯等生物質都能夠產生纖維素酶、果膠酶和半纖維素酶等復合多酶。國內專利大多利用麩皮、秸稈、甜菜渣、蘋果渣等為復合碳源制備酶制劑，利用桔皮粉作為唯一碳源制備酶制劑還未見報道。?

黑曲霉（Aspergillusniger）作為生產宿主通常認為是安全的（GRAS），而且能在合理的時間內產酶，因此成為生產酶制劑的一種非常重要的菌種。但從公開報道的文獻中可以看出，對于其產果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶的研究大多集中在菌種篩選、鑒定及發酵條件的優化上面。但是用于酶制劑的生產，其酶活力水平仍然不夠高，因此亟待找到限制其產酶能力的外部因素并優化其培養條件。?

眾所周知，諸如曲霉、木霉等真菌在降解植物細胞壁時產生胞外酶，因此分泌胞外酶與細胞通透性有直接關系，Tangnu等人發現合適濃度的Tween-80能夠促進木霉分泌纖維素酶、半纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的能力，曾光明等人通過在綠色木霉發酵纖維素的培養基中添加鼠李糖脂顯著提高其酶活力，Callow等人發現鼠李糖脂和Triton?X-100能夠促進里氏木霉產纖維素酶的能力，但是利用表面活性劑促進桔皮粉的降解產酶卻是一個空白。因此，利用?一種價格低廉，低毒性環境友好的表面活性劑進行生物發酵桔皮粉生產酶制劑具有良好開發前景。?

發明內容

本發明目的之一在于提供一株利用桔皮粉發酵產果膠酶制劑的日本曲霉（Aspergillus?japonicus）PJ01。本發明涉及的日本曲霉菌株已于2013年7月9日提交保藏。保藏單位為中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCC?NO：M2013323，分類命名為日本曲霉PJ01Aspergillus?japonicus?PJ01。?

日本曲霉（Aspergillusjaponicus）PJ01的形態特征：PDA平板上35℃培養1天為白色菌絲，培養2天形成黑色產孢區，培養4天后菌落直徑為50-60mm（圖4）；分生孢子梗長1-3mm，直徑20-30μm，透明；分生孢子球型，褐黑色，直徑40-60μm；孢子直徑約為4-6μm，圓形。?

本發明所提供的日本曲霉（Aspergillusjaponicus）PJ01可用于制備果膠酶制劑，酶制劑中含果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等復合酶活力。日本曲霉（Aspergillusjaponicus）PJ01能夠在桔皮粉為唯一碳源的液體培養基上生長產酶，發酵工藝簡單可行，生長產酶迅速，橘皮廢棄物利用充分，產品附加值高等特點。?

本發明目的之二在于提供一種上述的日本曲霉（Aspergillusjaponicus）PJ01發酵來提高所產復合酶酶活的方法。?

1）斜面培養：將日本曲霉（Aspergillusjaponicus）PJ01孢子接種至PDA斜面培養基上，34-36℃培養3-5天，待孢子成熟后保藏至4℃；?

2）菌懸液制備：用含質量百分比0.02-0.1%的吐溫-80的生理鹽水洗下PDA斜面培養基曲霉孢子，制成孢子懸液；?