[發明專利]一種結球甘藍的單倍體植株培養方法

無效

• 申請號: 201310350474.4
• 申請日: 2013-08-13
• 公開（公告）號: CN103392603A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 張振超;潘躍平;戴忠良;毛忠良;吳國平;姚悅梅;秦文斌;肖燕;潘永飛;王建華;馬志虎;孫春青
• 申請（專利權）人: 鎮江瑞繁農藝有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及植物組織培養技術領域，尤其涉及一種提高結球甘藍頑固基因型小孢子胚胎發生的組織培養方法。

背景技術

結球甘藍(Brassica?oleracea?L.var.Capitata)又名卷心菜、洋白菜、包菜等，是十字花科、蕓薹屬的植物，為甘藍（Brassica?oleracea?L.）的一個變種。結球甘藍在我國栽培面積廣，適應性強，耐儲運，且含有較多的異硫氰酸鹽、類胡蘿卜素、維生素C等，經常食用，可預防癌癥的發生，對心血管病的預防也有較好的作用，因此深受廣大人民喜愛。

一般結球甘藍育種多采用多代自交分離純化，以選育自交不親和系培育新品種，這種方法純合速度慢，育種時間長，一般需5～8年時間，而且連續自交多代后存在植株衰退現象。近年來，雄性不育系在配制雜交種中的應用越來越普遍。然而，由于國內結球甘藍優良種質資源少，而國外表現優勢的親本資源又難以獲得，這些因素制約著我國甘藍優良品種選育工作的開展。通過游離小孢子培養方法可在短時間內獲得雙單倍體純系，比傳統的方法縮短了3～4年的育種進程，并且在優良自交系的創制和提高新品種選育的效率等方面具有重要作用。同時，也易于隱性性狀表達，從而豐富了育種資源。

自1982年Lichter首次報道油菜游離小孢子培養獲得再生植株以來，蕓薹屬作物尤其是油菜的小孢子培養，無論是在出胚率、出胚量，還是胚培養及再生植株方面都獲得了很大的成功。相對于甘藍型油菜來說，結球甘藍游離小孢子的培養難度較大。國外最早見于1989年Lichter等人的研究，隨后國內學者如嚴準等（華中農業大學學報,1999,18(1):5～7）、湯青林等（西南農業學報,2000,13(3):98～103）、劉艷玲等（西南農業大學，2006，28(3):339～446）、袁素霞等（植物學報,2010,45(2):226～232）也對結球甘藍小孢子培養技術應用做了大量研究，為生產應用打下了良好基礎。但結球甘藍小孢子胚胎發生的效率普遍不高，培養效果不好。研究表明，結球甘藍供體植株的基因型對小孢子胚胎發生的影響極為重要，它不僅影響產胚率，也影響胚狀體質量（Chuong?et?al.,1988），從而制約了在遺傳育種和基礎研究中的應用。

前人在提高游離小孢子出胚率方面做了一些有益探索，取得了一些成果。申請號為200910101722.5的中國發明專利申請中公開了一種青花菜高二倍體率小孢子再生植株的培養方法，主要通過改變常規培養基成分和培養方法，以提高植株的二倍體率；申請號為201210047243.1的中國發明專利申請中公開了一種提高結球甘藍胚胎出生率的培養方法，利用小孢子培養技術將結球甘藍和油菜小孢子共同培養，促進結球甘藍出胚，該方法提高結球甘藍的出胚率，但是由于是小孢子共同培養，對于得到的胚狀體可能是結球甘藍胚狀體，也可能是油菜胚狀體，要到田間種植后才能判斷，選育時間較長。

發明內容

本發明提供了一種結球甘藍的單倍體植株培養方法，采用結球甘藍頑固基因型游離小孢子與小麥子房按一定數目配比共培養，從而促進結球甘藍頑固基因型小孢子出胚，顯著提高結球甘藍的出胚率，且所需時間較短，操作方便。

一種結球甘藍的單倍體植株培養方法，包括以下步驟：

（1）取結球甘藍的花蕾和小麥子房，滅菌；

（2）將滅菌后的花蕾配制成小孢子懸浮液，將所述小孢子懸浮液和小麥子房置于培養液中混合培養，誘導獲得子葉型胚狀體；

（3）將子葉型胚狀體接入分化培養基中，培養獲得再生植株；

（4）從再生植株切取再生芽，接入生根培養基，獲得完整植株。

本發明方法為小麥子房與結球甘藍小孢子混合培養，因為結球甘藍小孢子是游離狀態的，小麥子房對結球甘藍小孢子胚胎發生具有良好促進作用，同時，結球甘藍的小孢子胚胎發生、發育過程中都能與小麥子房顯著區分，培養得到的胚狀體在初期即可確定是結球甘藍的胚狀體，因此在再生植株移栽時不需要對小孢子植株進行區別鑒定，從而減少了工作量，提高了選擇效率，本方法簡便易行，易于操作。

步驟（1）中滅菌時所用滅菌液成分為次氯酸鈉56mL/L+99%酒精100mL/L+洗滌精200μL。

作為優選，所述結球甘藍花蕾與小麥子房數量比為1：4～8。

進一步優選，所述結球甘藍的花蕾為處于單核晚期至雙核早期的結球甘藍花蕾；所述小麥子房取自受精前2～3天的小麥麥穗。

更進一步優選，所述結球甘藍花蕾的花瓣和花藥長度比為0.7～1.2：1；花蕾滅菌后置于無菌NLN-13液體培養基中預培養1～3天。