[發(fā)明專利]沙門氏菌富集和快速檢測方法

有效

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• 申請日: 2013-08-13
• 公開（公告）號: CN103439497A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賴衛(wèi)華;山珊
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，具體采用雙功能納米金磁微粒集成免疫磁珠捕獲技術(shù)和免疫層析快速檢測沙門氏菌。

技術(shù)背景

沙門氏菌是自然界普遍存在的一種食源性致病菌，在世界各地的食物中毒中沙門氏菌引起的中毒病例占第一位，常引起人類急性腹瀉、嘔吐、腹部疼痛、高燒和敗血癥等疾病。沙門氏菌危害較大，在2006年歐盟調(diào)查中大約有160,049人被確認(rèn)感染了沙門氏菌。2008年4月到8月，美國有286人感染，2人死亡。2010年美國因沙門氏菌污染，召回了約5億枚污染雞蛋。2010年在日本4090個農(nóng)場中抽取203個調(diào)查，結(jié)果有48個農(nóng)場顯示陽性，占調(diào)查的23.6%。2012美國聯(lián)邦食品和藥物管理局(FDA)統(tǒng)計，美國每年大約有400人死于沙門氏菌。

目前，檢測沙門氏菌的方法有傳統(tǒng)分離鑒定法、PCR方法、生物傳感器方法、免疫學(xué)方法等。為了加快沙門氏菌的檢測速度，人們采用免疫磁珠的方法對樣品進(jìn)行富集。一些研究把免疫磁捕獲和實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合起來，檢測食品中的沙門氏菌。PCR方法和生物傳感器方法都具有較高的檢測靈敏度，一般可將檢測時間減少至24-48小時（依據(jù)不同檢測項目而言），但是該方法要求具有較高素質(zhì)的操作人員、較好的檢測儀器以及檢測條件，因此較難在基層以及企業(yè)大面積推廣使用，同時檢測時間仍很難滿足企業(yè)對出廠前產(chǎn)品質(zhì)量安全進(jìn)行快速反應(yīng)的實際需求，且該方法無法分辨死/活致病菌以及DNA片段的同源性，易造成假陽性偏高的結(jié)果；而在檢測很多食品基質(zhì)時，又會因為一些物質(zhì)的存在而抑制了DNA聚合酶的活性，從而造成假陰性。免疫學(xué)尤其是免疫層析方法，不需復(fù)雜儀器設(shè)備，檢測時間快（一般15?min即可獲得結(jié)果），易操作，但目前該類方法總體檢測靈敏度偏低(需要細(xì)菌濃度需達(dá)到10^5-6?CFU/mL)，因此針對食品樣品檢測，往往需要較長的增菌時間。目前沙門氏菌免疫學(xué)方法，采用膠體金免疫層析技術(shù)檢測，從增菌到檢測需要至少24小時才能實現(xiàn)25?g樣品中單菌的檢測。

由于微生物的生長具有其特定的生理周期，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件縮短時間效果不明顯；因此多采用免疫磁珠分離技術(shù)富集。依賴于特異性抗體的免疫磁珠分離技術(shù)可有效地提高待測微生物的檢測靈敏度，已逐漸成為食源性致病菌特異性分離和濃縮的最有效手段之一，并廣泛應(yīng)用于沙門氏菌等食源性致病菌的富集，大大縮短了食源性致病菌整體檢測時間。

以膜為固相載體的膠體金免疫層析法是20世紀(jì)80年代在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型檢測方法。由于其快速、便捷、不需特殊設(shè)備、結(jié)果判斷直觀、可以現(xiàn)場進(jìn)行檢測的特點，近年來越來越受到人們的重視，其技術(shù)發(fā)展迅速，在的檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但是對于某些抗原或抗體含量極低的樣本，標(biāo)記物的顏色很淡幾乎用肉眼難以判斷結(jié)果，雖然目前市場上有針對膠體金等標(biāo)記的免疫層析試紙條判讀的儀器，但是這種儀器僅能對在固相載體表面的標(biāo)記物顏色檢測，而對固相載體內(nèi)部的標(biāo)記物很難檢測到，因此檢測的靈敏度受到很大限制。同時檢測的生物樣本中可能含有顏色物質(zhì)會嚴(yán)重影響檢測的結(jié)果和靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種快速、靈敏、簡便的沙門氏菌定性、定量檢測技術(shù)。

本發(fā)明具體方案如下：