[發明專利]熒光微球標記沙丁胺醇多克隆抗體的方法

無效

• 申請號: 201310348226.6
• 申請日: 2013-08-12
• 公開（公告）號: CN103472221A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 賴衛華;彭濤
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明屬于食品安全中β₂-受體激動劑殘留檢測領域，具體涉及一種用熒光微球標記沙丁胺醇多克隆抗體的偶聯物及其制備方法。

背景技術

沙丁胺醇(Salbutamol)也屬于β₂-受體激動劑，而且近年來被用作鹽酸克倫特羅的主要替代品。眾所周知，β₂-受體激動劑類藥物用于畜牧養殖業可促進飼料轉化率、增加瘦肉產量。當人類食用β₂-受體激動劑殘留量高的動物性食品后，可能會導致人出現心悸、頭疼、目眩、惡心等癥狀，而且對肝、腎有一定的損害，我國及世界上許多其他國家已將該類藥物列為禁用藥物然而，但因為經濟利益的驅使且上級缺乏有效的檢測體系，目前養殖領域仍存在β₂-受體激動劑類藥物的非法使用現象。另外，在國家的高壓態勢下瘦肉精已得到了很好的控制，但一些不法分子為謀取經濟利益，在養殖場非法使用萊克多巴胺、沙丁胺醇等代替瘦肉精作為促生長劑。

免疫層析技術由于具有快速、準確、方便的優點，在鹽酸沙丁胺醇及其替代物的檢測應用上已得到很大的推廣，它是以抗原抗體間的特異性反應為基礎，通過標記物對某種物質進行定性或定量檢測的研究手段。目前，常用于免疫層析技術檢測鹽酸沙丁胺醇的標記物有膠體金、熒光微球等，這些標記物保持了沙丁胺醇多克隆抗體的活性，而標記物的活性不受影響，當它與相應抗原反應后，可以直接測定復合物中的標記物，直接對目標物質進行定性甚至定量分析。

目前，標記物與抗體之間大多是通過共價鍵或物理吸附的方式直接偶聯，特別是β-受體激動劑抗體的標記。該種偶聯方式有偶聯時間短、操作簡單的優點，但這種偶聯方式，由于抗體任意與標記物結合使一些抗原結合位點被屏蔽，即所謂的空間位阻，導致抗體標記效率和標記物的分散性降低。

發明內容

本發明的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供熒光微球標記沙丁胺醇多克隆抗體的方法，該方法減少了抗體與熒光微球相連的空間位阻，提高了標記效率高，制得的偶聯物能表現出良好的膠體穩定性和結合性能。

為了實現上述目的本發明采取的技術方案是：

熒光微球標記沙丁胺醇多克隆抗體的方法，其特征在于：(1)氨基修飾的熒光微球與活潑酯化的生物素在PBS溶液中偶聯反應2?h得到熒光微球-生物素偶聯物，再離心、洗滌除去未結合的生物素；(2)將鏈霉親和素與熒光微球-生物素偶聯物混合輕搖反應?2?h后，離心、用PBS溶液洗滌移除未偶聯的鏈霉親和素，得到熒光微球-生物素-鏈霉親和素偶聯物；(3)將生物素化的沙丁胺醇多克隆抗體加入到熒光微球-生物素-鏈霉親和素的偶聯物溶液中輕搖反應1?h后，洗滌、離心以除去未偶聯上的生物素化沙丁胺醇多克隆抗體，即得到熒光微球標記沙丁胺醇多克隆抗體即熒光微球-生物素-鏈霉親和素-生物素化沙丁胺醇多克隆抗體；?????所述活潑酯化的生物素為將生物素-PEG₅₀₀₀復合物溶于DMF溶液中，加入二環己基碳亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺后室溫攪拌反應24?h，然后離心棄沉淀，得到活潑酯化的生物素；?????所述氨基修飾的熒光微球的制備方法：10?mg熒光微球洗凈后超聲溶解于1?mL蒸餾水中，加入20?μL冰乙酸和20?μL?(3-三甲氧基硅丙基)-二乙基乙二胺超聲溶解后，磁力攪拌3～4?h，用10?mM的MES緩沖液(pH5.5)洗滌并重懸；所述熒光微球粒徑為175?nm。

所述生物素化沙丁胺醇多克隆抗體的的制備方法：用1?mL?DMSO溶液溶解生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHSB)配制成濃度為1?mg/mL的溶液，取120?μL加入到1?mL濃度為2.3?mg/mL的沙丁胺醇多克隆抗體溶液中，在室溫下持續攪拌，保溫2~4?h；然后加入9.6?μL的NH₄Cl?(1?mol/L)溶液在室溫下攪拌10?min，用PBS溶液在4℃下充分透析除去游離的生物素；將透析完后的樣品上1?ml?的分子篩柱，以PBS溶液緩慢洗脫，抗體在1~3?ml?之間洗下，再在收集到的目標產物中加入疊氮鈉及1.0?g/L的BSA溶液，在4?℃下避光保存備用。

所述鏈霉親和素與熒光微球-生物素偶聯物混合反應的投料摩爾比為1000:1。

所述熒光微球標記生物素化沙丁胺醇多克隆抗體與熒光微球-生物素-鏈霉親和素的偶聯物的投料摩爾比為1:1000。

本發明的有益效果是：