[發明專利]肝衰竭預后的GSTM3基因甲基化定量檢測法及試劑盒

無效

• 申請號: 201310346483.6
• 申請日: 2013-08-12
• 公開（公告）號: CN103525907A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 王凱;王麗媛;趙靜;高帥;孫豐凱;范玉琛
• 申請（專利權）人: 山東大學齊魯醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 濟南魯科專利代理有限公司 37214
• 代理人: 周長義;崔民海

技術領域

本發明屬于醫學領域，是一種檢測與肝衰竭預后相關基因甲基化程度的檢測法及試劑盒，尤其是一種定量檢測谷胱甘肽S-轉移酶M3啟動子甲基化程度的檢測法和試劑盒。?

背景技術

慢加急性肝衰竭（ACHBLF）是以黃疸、凝血功能障礙、肝性腦病及腹水等為主要表現的一組臨床癥候群。它發生在慢性肝病的基礎上，是由多種因素引起的大面積肝細胞壞死或嚴重肝損害，導致肝臟合成、排泄、生物轉化與解毒等功能發生嚴重障礙或失代償。慢加急性肝衰竭可由多種原因誘發，在我國其主要病因是慢性乙型肝炎(CHB)。乙型肝炎重癥化由多基因、多因素所致，其發病機制非常復雜。目前研究表明，重癥乙型肝炎的發生和發展主要由病毒和宿主兩大因素相互作用所致。同時，乙醇、藥物、化學毒物、生物毒物、乙肝病毒（HBV）耐藥變異、免疫抑制劑及合并感染等因素也被證實能夠導致慢性HBV感染者的急性發病，表現為慢加急性肝功能衰竭，稱為慢加急性重型乙型病毒性肝炎（ACHBLF）。該疾病病情兇險，進展迅速，國內外報告的病死率高達60%-80%，預后差，且臨床上并無有效評估病情、判斷療效和預測預后的體系，其臨床救治仍是醫學難題。因此，揭示乙型肝炎重癥化的機制，建立有效的綜合評估預后體系，制訂有效的防治手段具有重大意義。?

研究表明，表觀遺傳在慢性HBV感染的重癥化過程中發揮重要作用，已逐漸成為醫學領域的研究熱點。其研究范疇主要包括脫氧核糖核酸（DNA）甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA調控。其中，DNA甲基化是表觀遺傳學的重要調控機制之一，它是在DNA甲基轉移酶（DNMT）的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸中的甲基轉移至胞嘧啶的5-碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。在人類基因組中，CpG序列出現率僅1%，但在某些區域存在鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區，形成CpG島。而甲基化則主要發生于CpG島的胞嘧啶上。CpG島的甲基化可使基因沉默、失活，影響基因轉錄，調控基因表達，而非甲基化則與基因活化密切相關。研究證實，感染HBV的宿主均存在DNMT表達上調的現象，因此，HBV可通過增強DNMT的活性，促使病毒DNA啟動子發生甲基化，抑制病毒DNA轉錄，從而抑制病毒的復制。?

肝衰竭患者體內存在不同程度的氧化損傷。氧化損傷在肝衰竭的發生發展過程中發揮重要作用。谷胱甘肽S-轉移酶（GST）是主要存在于肝細胞內的Ⅱ相代謝酶，可促進谷胱甘肽與毒性代謝產物結合，清除細胞內自由基，可使有害的親電物質與谷胱甘肽結合，將其排出體外，從而發揮保護機體核酸和蛋白質的功能。GST超家族主要有4個亞家族—α、μ、π、θ，分別為GSTA、GSTM、GSTP、GSTT。其中，谷胱甘肽S-轉移酶M3（GSTM3）是μ亞家族的重要成員之一，它在與環境致癌物質的結合與脫毒過程中作用巨大，同時也具有極強的抗氧化能力。研究表明，GSTM3基因甲基化程度與其表達水平間存在明顯的負相關。GSTM3基因啟動子的高甲基化可以使GSTM3表達減低，進而導致機體抗氧化能力減低，氧化損傷加重，正常的肝功能受損。甲基化特異性聚合酶鏈反應（MSP-PCR）法是目前應用最為廣泛的DNA甲基化檢測方法，具有較強的特異性、敏感性和可操作性。但是MSP-PCR只能作定性研究且其聚合酶鏈反應（PCR）條件需嚴格控制。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種能定量檢測與肝衰竭預后相關的谷胱甘肽S-轉移酶M3（GSTM3）基因甲基化程度的檢測方法及試劑盒，為肝衰竭的臨床診斷和治療提供科學依據。?

本發明是這樣實現的，肝衰竭預后的GSTM3基因甲基化定量檢測試劑盒內設有提取外周血基因組DNA的試劑，對基因組DNA進行重亞硫酸鹽修飾的試劑，5×預混PCR反應體系，以及針對目的基因GSTM3啟動子的甲基化特異性引物對和Taqman熒光探針、內參基因ALU-C4的特異性引物對和Taqman熒光探針：?

GSTM3-上游引物：5’CGTACGGTTTTGTGGAGTC?3’；

GSTM3-下游引物：5’TCCGAACCTTCGAAAACTAA?3’；

GSTM3-探針:?5’Fam?AAACCCACGCGCGAACGCC?3’BHQ1；

ALU-C4-上游引物：5’GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA?3’；

ALU-C4-下游引物：5’ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA?3’；

ALU-C4-探針:?5’Fam?CCTACCTTAACCTCCC?3’BHQ1。