[發明專利]肝衰竭預后的GSTM3基因甲基化定量檢測法及試劑盒

無效

• 申請號: 201310346483.6
• 申請日: 2013-08-12
• 公開（公告）號: CN103525907A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 王凱;王麗媛;趙靜;高帥;孫豐凱;范玉琛
• 申請（專利權）人: 山東大學齊魯醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 濟南魯科專利代理有限公司 37214
• 代理人: 周長義;崔民海

1.肝衰竭預后的GSTM3基因甲基化定量檢測法及試劑盒，其特征在于：盒內設有提取外周血基因組DNA的試劑，對基因組DNA進行重亞硫酸鹽修飾的試劑，5×預混PCR反應體系，以及針對目的基因GSTM3啟動子的甲基化特異性引物對和Taqman熒光探針、內參基因ALU-C4的特異性引物對和Taqman熒光探針：

GSTM3-上游引物：5’CGTACGGTTTTGTGGAGTC?3’；

GSTM3-下游引物：5’TCCGAACCTTCGAAAACTAA?3’；

GSTM3-探針:?5’Fam?AAACCCACGCGCGAACGCC?3’BHQ1；

ALU-C4-上游引物：5’GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA?3’；

ALU-C4-下游引物：5’ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA?3’；

ALU-C4-探針:?5’Fam?CCTACCTTAACCTCCC?3’BHQ1。

2.根據權利要求1所述的肝衰竭預后的GSTM3基因甲基化定量檢測試劑盒，其特征在于：盒內設有標準品，陽性對照和陰性對照。

3.根據權利要求2所述的肝衰竭預后的GSTM3基因甲基化定量檢測試劑盒，其特征在于：該陽性對照為重亞硫酸鹽修飾的100%甲基化的人基因組DNA。

4.根據權利要求2所述的肝衰竭預后的GSTM3基因甲基化定量檢測試劑盒，其特征在于：該陰性對照為高壓的雙蒸餾水。

5.根據權利要求2所述的肝衰竭預后的GSTM3基因甲基化定量檢測試劑盒，其特征在于：該標準品為包含目的基因片段的質粒。

6.肝衰竭預后的GSTM3基因甲基化定量檢測法，其步驟在于：首先，提取待測樣本外周血基因組DNA，對基因組DNA進行重亞硫酸鹽修飾，分別用目的基因GSTM3啟動子的甲基化特異性引物對和Taqman熒光探針、內參基因ALU-C4的特異性引物對和Taqman熒光探針，對處理過的DNA進行實時定量聚合酶鏈式（PCR）反應,?其中陰性對照是將體系中DNA模板替換為高壓的雙蒸餾水，陽性對照是將體系中DNA模板替換為100%甲基化的人基因組DNA，即從健康人白細胞中提取的DNA，?通過CpG甲基化轉移酶進行體外甲基化后，通過重亞硫酸鹽修飾獲得，實時定量甲基化特異性PCR方法對目的基因GSTM3和內參基因ALU-C4進行擴增；以標準品的擴增結果制備標準曲線；采用實時定量甲基化特異性PCR的方法，同時對重亞硫酸鹽處理后的樣品DNA分別檢測目的基因GSTM3和內參基因ALU-C4的閾值循環值，計算出目的基因GSTM3甲基化程度的定量值。

7.根據權利要求6所述的肝衰竭預后的GSTM3基因甲基化定量檢測法，其特征在于：采用重亞硫酸鹽對基因組DNA進行甲基化修飾，將非甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，用作擴增模板。

8.根據權利要求6所述的肝衰竭預后的GSTM3基因甲基化定量檢測法，其特征在于：通過熒光PCR儀獲得各PCR反應管的甲基化反應的閾值循環值，其GSTM3甲基化的計算公式為：甲基化率=100%×2?exp-[ΔCp(樣品GSTM3?Cp值-樣品ALU-C4?Cp值)-?ΔCp（陽性對照GSTM3?Cp值-陽性對照ALU-C4?Cp值）]。