[發明專利]一種利用全細胞催化制備他汀側鏈中間體的方法

有效

• 申請號: 201310345732.X
• 申請日: 2013-08-09
• 公開（公告）號: CN104342460B
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發明（設計）人: 陳令偉
• 申請（專利權）人: 南京朗恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司32206
• 代理人: 顧進

技術領域

本發明涉及生物不對稱合成領域，具體涉及一種利用全細胞催化制備他汀側鏈中間體的方法。

背景技術

他汀類藥物是目前世界上最暢銷的藥物大類，它對膽固醇合成的關鍵限速酶3-羥基-3-甲基輔酶A（HMG-CoA）還原酶具有強烈的抑制作用，可抑制膽固醇的合成，是治療心血管疾病的重要藥物，特別是阿托伐他汀和羅素伐他汀近些年都進入了全球最暢銷藥前十名。(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羥基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN 或OR)是合成此類降膽固醇藥物的關鍵手性中間體，可以通過化學法或生物法加以制備。目前國內主要通過化學法生產，化學還原方法的反應條件往往需要低溫(如-70 ℃)，及易燃的硼烷類化合物參與，成本高，純度低，污染尤其嚴重，對環境的影響非常大。相比較而言，生物法的反應條件溫和，更加實用和環保。

目前生物法主要有酶法和全細胞催化兩種。例如美國專利US2008/0248539 公開了一種利用來自于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的酮還原酶及其突變株還原法生產(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法，該方法利用外源添加的葡萄糖脫氫酶和輔酶因子來維持反應的進行，而且在反應中會產生葡萄糖酸，需用堿維持反應的pH，增加了操作程序，影響反應的原子經濟性。國內專利CN 102978249公開了一種酮還原酶生產(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法，該方法添加的是凍干酶粉，而且添加了價格昂貴的輔酶因子，成本較高，無法進行大規模產業化應用。國內專利CN 102643757公開了利用在土壤中篩選到的季也蒙畢赤酵母菌催化生產(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法，但天然菌株全細胞目的酶活低，雜酶種類多，催化存在著效率低，產物純度不高等不足。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種反應步驟簡單、成本較低、產品純度高，可大規模生產(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羥基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN 或 OR)的綠色生物制備方法。

為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案如下：一種利用全細胞催化制備他汀側鏈中間體的方法，其特征在于：在反應容器中加入配制好的所述水相緩沖液，然后依次加入底物(5S/R)-6-X-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=Cl,CN 或OR)、異丙醇、重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞，于溫度25℃～40℃下攪拌反應，利用氣相色譜方法（GC）檢測反應進程，至反應轉化率達到95%～100％時結束反應，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發脫去溶劑，即得(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羥基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN 或 OR)。

所述的含有重組酮還原酶的大腸桿菌細胞的制備方法為：將含有酮還原酶(KRED)基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30～38℃下，搖床180-220rpm振蕩培養4～8小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30～38℃下，搖床180-220rpm振蕩培養，培養至OD₆₀₀值達到0.8～1.2時，加入誘導劑，于22～32℃下繼續培養16～20小時，4℃下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞。

進一步地，所述的誘導劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，乳糖等，誘導終濃度為0.2～1.0mM，其中優選異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

進一步地，所述的水相緩沖液濃度為20～200mM，為三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液，pH為6.0～8.0；其中更優選三乙醇胺緩沖液， pH6.5～7.5。

所述所述的水相緩沖液為50mM三乙醇胺緩沖液，其配置方法為：稱取三乙醇胺7.45g，EDTA 1.48g，加去離子水700ml 溶解后，加入濃HCl調pH至7.0，補加去離子水至1000ml。

進一步地，反應起始時的反應體系中，底物(5S/R)-6-X-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=Cl,CN 或 OR)的濃度為10％～30％(w/v)，重組酮還原酶的大腸桿菌細胞的用量為底物質量的10％～30％(w/w)，異丙醇的濃度為3％～12％(w/v)。根據一個優選方面，反應起始時的反應體系中，底物(5S/R)-6-X-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=Cl,CN or OR)的濃度為12％～20％(w/v)，反應中無需添加輔酶因子。