[發明專利]一種利用全細胞催化制備他汀側鏈中間體的方法

有效

• 申請號: 201310345732.X
• 申請日: 2013-08-09
• 公開（公告）號: CN104342460B
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發明（設計）人: 陳令偉
• 申請（專利權）人: 南京朗恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司32206
• 代理人: 顧進

1.一種利用全細胞催化制備他汀側鏈中間體的方法，其特征在于：在反應容器中加入配制好的水相緩沖液，然后依次加入底物(5S/R)-6-X-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯、異丙醇、含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞，于溫度25℃～40℃下攪拌反應，利用氣相色譜方法檢測反應進程，至反應轉化率達到95%～100％時結束反應，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發脫去溶劑，即得(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羥基己酸叔丁酯；其中X=Cl或CN；

反應起始時的反應體系中，底物(5S/R)-6-X-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯的濃度為10％～30％(w/v)，含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞的用量為底物質量的10％～30％(w/w)，異丙醇的濃度為3％～12％(w/v)，其中X= Cl或CN；

含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞的制備方法為：將含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素的液體LB培養基中，于30～38℃下，搖床180-220rpm振蕩培養4～8小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素的液體LB培養基中，于30～38℃下，搖床180-220rpm振蕩培養，培養至OD₆₀₀值達到0.8～1.2時，加入誘導劑，于22～32℃下繼續培養16～20小時，4℃下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞。

2.根據權利要求1所述的利用全細胞催化制備他汀側鏈中間體的方法，其特征在于：所述的誘導劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖，誘導終濃度為0.2～1.0mM。

3.根據權利要求1所述的利用全細胞催化制備他汀側鏈中間體的方法，其特征在于：所述的誘導劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

4.根據權利要求1所述的利用全細胞催化制備他汀側鏈中間體的方法，其特征在于：所述的水相緩沖液濃度為20～200mM，為三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液，pH為6.0～8.0。

5.根據權利要求4所述的利用全細胞催化制備他汀側鏈中間體的方法，其特征在于：所述的水相緩沖液為pH 6.5～7.5的三乙醇胺緩沖液。

6. 根據權利要求5所述的利用全細胞催化制備他汀側鏈中間體的方法，其特征在于：所述的水相緩沖液為50mM三乙醇胺緩沖液，其配置方法為：稱取三乙醇胺7.45g，EDTA 1.48g，加去離子水700ml 溶解后，加入濃HCl調pH至7.0，補加去離子水至1000ml。

7.據權利要求6所述的利用全細胞催化制備他汀側鏈中間體的方法，其特征在于：底物(5S/R)-6-X-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯的濃度為12％～20％(w/v)，其中 X=Cl或CN 。

8.據權利要求7所述的利用全細胞催化制備他汀側鏈中間體的方法，其特征在于：在反應體系中加入Ca²⁺或Mg²⁺的二價金屬離子，濃度為0.5-20mM。