[發明專利]一種鑒別擬枝孢鐮刀菌和木賊鐮刀菌感染致木耳白毛菌病的方法

無效

• 申請號: 201310344069.1
• 申請日: 2013-08-08
• 公開（公告）號: CN103409522A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 孔祥輝;張介馳;張丕奇;劉佳寧;王玉文;韓增華;馬慶芳;戴肖東;黨阿麗;馬銀鵬
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 哈爾濱市偉晨專利代理事務所(普通合伙) 23209
• 代理人: 榮玲

技術領域

本發明涉及一種鑒定木賊鐮刀菌（Fusarium?equiseti）和擬枝孢鐮刀菌（Fusarium?sporotrichioides）感染導致木耳“白毛菌病”的分子生物學方法。?

背景技術

木耳[Auricularia?auricula-judae(Bull.)Quél.]，又名黑木耳、光木耳，為著名的食用菌和藥用菌，其質地滑嫩，清脆可口，營養豐富，有“素中之葷”的美譽。木耳有較高的藥用價值，能補氣血，涼血止血，潤肺益胃，舒筋活絡，輕身強志，還有降低血小板凝聚、防治心腦血管疾病的奇效。此外還可抑制癌細胞，增強人體免疫功能，成為公認的“天然保健食品”，越來越受到市場的青睞。木耳栽培起源于中國，作為世界木耳的主產國，2011年中國木耳產量超過300萬噸，遍及全國二十多個省（區）。我國木耳主產區東北產區因氣溫低、晝夜溫差大等獨特的氣候特點使所生產的木耳色黑肉厚，品質好，聞名遐邇。因此，木耳栽培生產范圍也逐年擴大，配套栽培設施和技術逐漸完善，產量也不斷提高，木耳產業已發展成為我國許多山區和林區的富農產業。然而，由于在木耳栽培生產中可發生多種病害或雜菌污染，導致木耳品質下降、產量降低，病害嚴重的甚至絕產，木耳產業的健康發展則受到了嚴重威脅。?

近年來，在東北產區春季木耳普遍發生了被木耳栽培農民稱為“白毛菌”的病害，已給許多栽培農戶造成了較大的經濟損失。該病原菌在盛夏伏天侵染木耳的子實體，在耳片腹面生長一層白色網狀霉菌，呈絨毛狀，即使在木耳曬干后霉層依然存在，在嚴重發生時可導致耳片霉爛，嚴重影響木耳的產量及商品價值（見圖1和2）。病害一旦發生，就會導致大面積蔓延，因此，對該病害病原菌進行及時準確的鑒定及采取針對性的有效防治措施十分必要。只有盡快鑒定病原菌種類，才能采取相應措施對該病害進行有效防治，防止病害迅速蔓延，將損失減少到最小，具有十分重要的意義。?

迄今為止，申請人于2011年報道了尚志地區的“白毛菌”病害，證明了引起木耳“白毛菌病”的病原菌為尖孢鐮孢（F.oxysporum）和厚垣鐮孢（F.chlamydosporum）。鑒定方法是通過形態鑒定和ITS序列分析，即通過提取病原菌DNA，用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，獲得的PCR產物進行測序?分析，將序列在NCBI中進行BLAST分析，通過與已知序列的高同源性并結合病原菌培養的菌絲及孢子形態來確定病原菌，方法繁瑣、耗時長。?

發明內容

本發明的目的是提供一種更加快速而準確鑒定木賊鐮刀菌（Fusarium?equiseti）和擬枝孢鐮刀菌（Fusarium?sporotrichioides）感染導致木耳“白毛菌病”的分子生物學方法，利用一對特異性引物鑒別木耳白毛菌病的病原菌，方法快速，縮短鑒定時間，可以及時采取防治措施，減少病害造成的損失。?

本發明按照如下方法鑒別擬枝孢鐮刀菌和木賊鐮刀菌感染致木耳“白毛菌病”：?

挑取黑木耳病變部位霉層或菌絲少許，加無菌蒸餾水煮沸后離心，取上清液作為模板，采用一對特異性引物，進行PCR反應，產物進行瓊脂糖凝膠電泳40min，查看條帶確定病原菌，若PCR產物大小為400bp，則為木賊鐮刀菌（F.equiseti）；若PCR產物大小為332bp，則為擬枝孢鐮刀菌（F.sporotrichioides），具體步驟如下：?

1、用無菌接種針挑取黑木耳病變部位霉層或菌絲少許，置于含100～500μL無菌水的1.5ml離心管中，煮沸5～10min，5000～10000rpm/min離心1～10min，取上清液0.1～5.0μL作為模板。?

2、PCR反應的引物由TaKaRa公司合成。?

引物1：?

E-P1：TTACCAGTAACGAGGTGTATG；?

E-P2：CATACCTATACGTTGCCTCG；?

引物2：?

S-P1：AAAAGCCCAAATTGCTGATG；?

S-P2：TGGCATGTTCATTGTCACCT；?

3、鑒定由木賊鐮刀菌（F.equiseti）感染致木耳白毛菌病的PCR反應體系：25～100μl，含2.5～10μl10×PCR-Buffer，2.5～10μl?dNTPs(500μM)，0.5～5.0μl?Taq?DNA聚合酶，0.1～5.0μl上游引物E-P1(0.6～3.0μM)，0.1～5.0μl下游引物E-P2(0.6～3.0μM)，模版0.1～10.0μl，其余用無菌水補齊。?

PCR反應流程：?