[發明專利]利用特征多肽制備家蠶絲素蛋白特異抗體的方法

有效

• 申請號: 201310342720.1
• 申請日: 2013-08-07
• 公開（公告）號: CN103509107A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 鄭秦;吳小鋒;鄭海玲;周旸
• 申請（專利權）人: 浙江大學;中國絲綢博物館
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/06
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 陳昱彤

技術領域

本發明涉及多克隆抗體制備方法，尤其涉及一種制備家蠶絲素蛋白特異抗體的方法。

背景技術

家蠶是我國重要的經濟昆蟲，以產生蠶絲為目的。蠶絲主要由絲素和絲膠兩種蛋白質組成，但絲膠蛋白在繅絲過程中脫落，因此，絲織品、絲綢產品等中主要的成分是絲素蛋白。一方面，目前在紡織品市場，假冒絲綢產品較多，侵犯了消費者權益，嚴重影響了我國絲綢長期以來的良好聲譽，因此，有必要建立科學嚴謹的檢測分析方法。另一方面，在絲綢起源研究領域，也迫切需要更科學的分析方法，因為古代埋入墓葬或遺址中的絲織品隨著時間的推移，易受多種因素影響而遭到降解，外界的光照、酸、堿、微生物等環境因素，都會造成蠶絲蛋白質發生變性和大分子鏈的斷裂，使之降解成肽段或氨基酸，因此利用傳統由天然蛋白質大分子制備的抗體很難來檢測這樣已經遭到破壞的抗原蛋白，這樣就很難來探尋絲綢的起源，且年代越早的證據越難尋覓。因此如何采用自然科學的先進手段，建立絲織品微痕檢測技術體系，從印痕、殘留物、土壤中提取古代絲綢的信息，對絲綢起源研究非常迫切。目前蛋白質檢測的先進技術是基于抗體-抗原的Western?Blotting或ELISA方法，但制備抗體常采用天然蛋白質大分子，因此，無法滿足上述研究。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用特征多肽制備家蠶絲素蛋白特異抗體的方法。

為了達到上述目的，本發明采用的技術方案是：本發明利用特征多肽制備家蠶絲素蛋白特異抗體的方法包括以下步驟：

步驟一：利用Fmoc法合成序列為“CGAGAGSGAGAGS”的多肽，并通過所述多肽的N端的半胱氨酸使該多肽與載體匙孔血藍蛋白（KLH）偶聯得到完全抗原；

步驟二：用生理鹽水稀釋所述完全抗原，將稀釋后的完全抗原與完全弗氏佐劑混合，然后再加入鏈霉素和青霉素溶液進行乳化處理得到初次免疫抗原乳化液，使用初次免疫抗原乳化液對兔子進行初次免疫，然后對兔子進行加強免疫，加強免疫使用的是加強免疫抗原乳化液；所述加強免疫抗原乳化液是由所述稀釋后的完全抗原與不完全弗氏佐劑混合，然后再加入鏈霉素和青霉素溶液進行乳化處理得到；當兔子血樣中的抗體的效價達到1/10000時，收集免疫后的兔子的血液，并使血塊充分收縮及抗血清完全析出，然后收集抗血清并離心處理得到上清液。

進一步地，本發明在所述步驟二中，在配制初次免疫抗原乳化液時，稀釋后的完全抗原與完全弗氏佐劑是按體積比1:1進行混合；在配制加強免疫抗原乳化液時，稀釋后的完全抗原與不完全弗氏佐劑是按體積比1:1進行混合。

進一步地，本發明在所述步驟二中，對兔子進行所述初次免疫的方法是：使用初次免疫抗原乳化液對兔子的后大腿和皮下進行多點注射，每只注射100?ul；

對兔子進行所述加強免疫的方法是：在初次免疫后的第2、4、6周分別進行一次加強免疫，每次加強免疫是使用加強免疫抗原乳化液對兔子的后大腿和皮下進行多點注射，每只注射100?ul。

進一步地，本發明在所述步驟二中，使血塊充分收縮及抗血清完全析出的方法是：將所收集的血液置室溫下讓其凝固，然后將凝固血液置于37℃溫箱內放置30?min，再置于4℃冰箱過夜。

?與現有技術相比，本發明具有的有益效果是：

????（1）本發明方法通過家蠶（Bombyx?mori）絲素蛋白的特征多肽制備的多克隆抗體具有很強的特異性，經ELISA法分析可知，該抗體與家蠶絲素蛋白具有明顯的免疫反應，靈敏度很高，能夠用于檢測家蠶絲素蛋白，特別適合用于不完整絲素蛋白的檢測分析。?

（2）與傳統方法利用天然蛋白質的大分子制備的抗體不同，本發明制備的抗體不僅能夠檢測完整的絲素蛋白，也能用于檢測諸如古代絲織品中已經斷裂的絲素蛋白分子，從而為中國早期墓葬和遺址中的絲織品殘留物提供一種敏感特異快捷的辨識方法，為絲綢考古和起源分析提供新的科學證據，在考古、文物鑒定和其他科學研究中具有重要作用。

具體實施方式