[發明專利]一種檢測生長素類農藥或其結構類似物殘留的方法

有效

• 申請號: 201310340704.9
• 申請日: 2013-08-07
• 公開（公告）號: CN103468795A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 李崗;王強;蔡磊明;吳聲敢;趙學平;吳長興
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 向慶寧

技術領域

本發明屬于農藥殘留檢測方法，特別屬于一種生長素類或結構類似物殘留的檢測方法。

背景技術

農產品中農藥殘留問題日益受到人們廣泛的關注，而生長素類農藥，尤其是二氯喹啉、2，4-D等除草劑在水稻等作物田連年大量使用，造成這類除草劑在農產品中殘留超標。加強和建立對這類農藥殘留的檢測方法和監測技術研究對保障人們健康，保護生態環境具有重要意義。

目前農產品中農藥殘留檢測方法，大體上可分為兩類。一類是理化檢測法，它利用農藥獨特理化性質作為指標來確定農藥的種類和濃度。如分光光度法、原子吸收光譜法、薄層層析法、氣相色譜法、液相色譜法、同位素標記法、核磁共振波譜法、毛細管電脈儀技術（CZE），色質聯用技術（GC-MS、HPLC-MS），超臨界流體色譜技術（SFC），直接光譜分析技術等。但是，這些技術方法中最常用的是氣相色譜法和液相色譜法，具有靈敏高、重現性好等優點，但是一些缺點使其應用受到限制，如儀器昂貴、檢測成本高、儀器操作需專業人員，前處理要求較高，檢測同期長等缺點。

另外一類是生物檢測方法，其原理是利用農藥獨特的生物學效應作為檢測農藥的指標。首先，在個體或組織水平上，利用農藥對敏感生物的獨特的生長發育影響、如造成變色、畸形等表觀的改變為指標來確定農藥的種類和殘留量。如用玉米或其它指示植物根長受抑制來檢測土壤中磺酰脲類除草劑等。此法不需要儀器和前處理，對各種毒物都可以測定，但敏感生物不易獲得且敏感性不易保持，不能精確定量分析。其次蛋白質水平上。如，根據有機磷類農藥或氨基甲酸酯類農藥對乙酰膽堿堿酯酶（AChE）的抑制效應，開發的速測卡和速測儀，但該方法只能用于有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑檢測，其靈敏度受溫度影響，結果需用標準儀器檢驗方法進一步確認。再如，利用抗原與抗體的特異性結合的免疫分析法：酶聯免疫法（ELISA法），特異性強，靈敏度高，但抗體制備比較困難，不能肯定試樣中的農藥品種時，有一定的盲目性，易出現假陰，假陽性現象。

生物檢測方法比理化檢測方法更簡單環保，所以應該大力發展生物檢測方法。

發明內容

本發明小組驚訝的發現，利用植物中GH3(Gretchen?Hagen3)基因可以靈敏的檢測植物中生長素類農藥或其結構類似物殘留。

本發明選擇苗期剛離體的大豆葉片（來自3-5葉期植株）作為檢測對象，以離體葉片的葉柄部接觸吸收被檢樣品的水溶液，1小時后，提取大豆葉片的總RNA，反轉錄后用PCR擴增GH3基因，檢測處理大豆葉片中GH3表達量變化量。

一方面，本發明提供一種檢測液體樣本中是否含有生長素類農藥或其結構類似物殘留的方法，該方法包括：

（1）、摘取苗期大豆葉片，立即把葉柄侵入液體樣本中1小時，從藥液中取出大豆葉片用于總RNA的提取；同時取清水處理大豆葉片作對照；

（2）、以SKIP16基因為內參，以GH3.6為標志基因；檢測GH3基因在步驟1處理過的大豆體內的相對表達量；如果相對表達量大于5以上，則說明書樣本中含有生長素類農藥或與生長素農藥類似的結構。

在一些優選的方式中，內參SKIP16基因的序列為CD397253；GH3基因的序列為XM_003543231.1；檢測內參基因的引物序列為GAGCCCAAGACATTGCGAGAG和CGGAAGCGGAAGAACTGAACC；檢測GH3基因的引物序列為：CTCCACCAAAGACTATGTTCTTGAAGA和CTCTTGAAGGTGTCAGGGTCGA。

在一些優選的方式中，相對表達量大于10-15。優選的，相對表達量為10或15.

在另一些優選的方式中，所述的生長素農藥為苯氧羧酸類，二氯喹啉酸或多菌靈中的一種或幾種。在另一些優選的方式中，所述的生長素農藥為二氯喹啉酸。

在一些優選的方式中，相對表達量的檢測采用Real-Time?PCR，其條件如下：