[發明專利]抗體表達載體的構建方法

在審

• 申請號: 201310340307.1
• 申請日: 2013-08-07
• 公開（公告）號: CN104342449A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 吳晨衍
• 申請（專利權）人: 太倉美諾恒康生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種表達載體的構建方法，具體涉及一種抗體表達載體的構建方法。

背景技術

近年來，治療性抗體的研發取得了突破性的進展，使得治療性人單抗的研制成為生物技術領域的熱點。大容量抗體庫是制備人單抗的重要技術平臺，一個具有良好多樣性的大容量噬菌體抗體庫可以提供有效的獲取各種人源抗體的可靠手段。但構建性能良好的大容量抗體庫具有很高難度，需采取更好的技術路線并具備性能優越的表達載體。在抗體庫技術應用過程中，人們認識到以下因素對抗體庫的構建至關重要，首先由于細菌轉化效率的限制，達到10⁹以上的庫容需很大的工作量，為決這一難題，有人提出了利用loxp-cre定位重組系統構建大容量抗體庫的技術，因此需要適用于此系統的載體，而且不同的抗體基因在大腸桿菌的本底表達對細菌的生長有不同的毒性作用，影響細菌的生長，從而使抗體庫在擴增過程中多樣性越來越差，此外，在克隆抗體基因的過程中，如選用的限制性內切酶不當，也可因將抗體基因切斷而影響抗體庫的多樣性。

發明內容

為解決上述問題，本發明提出了一種抗體表達載體的構建方法，不但能夠保證抗體庫大的庫容量，并且避免了抗體庫擴增過程中的多樣性喪失。

為達到上述目的，本發明的技術方案如下：

一種抗體表達載體的構建方法，在將表達載體p3MH改造為PAL過程中，使用兩種DNA操作，其特征在于，包括以下步驟：

(1)表達載體的構建；

(2)噬菌體的制備和滴定；

(3)抗體基因的細胞內重組；

(4)酶聯免疫吸附劑測定。

進一步，所述表達載體p3MH為本實驗室在pCOMB3H的基礎上改造而成。

進一步，所述步驟(1)具體包括：在載體中插入人工合成的寡核苷酸和通過PCR介導的定位突變改造載體中的特定序列。

進一步，所述步驟(2)具體包括：挑選含有適當載體的單集落XL1-BLUE菌，接種到含氨芐青霉素和葡萄糖的培養基中。

進一步，所述步驟(3)具體包括：挑選單集落BS1365菌，在含有卡那霉素和葡萄糖的培養液中生長至對數增長期，通過稀釋鋪盤計數每毫升所含細菌數，將兩種噬菌體混合。

進一步，所述步驟(4)具體包括：將HbsAg用碳酸鹽溶液稀釋，擱置12小時，假如待測噬菌體樣本，在37度下孵育一小時，加OPD底物顯色，讀取A490值。

進一步，PCR介導的定位突變的操作步驟為：設計合成含有預期突變序列和適當限制性內切酶消化后，與相同內切酶消化的載體常規連接，連接物轉化感受態細菌，鋪盤選單集落提取質粒，用內切酶分析鑒定正確。

本發明提出了一種抗體表達載體的構建方法，不但能夠保證抗體庫大的庫容量，并且避免了抗體庫擴增過程中的多樣性喪失。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1是載體改造所合成的中藥引物列表；

圖2是p3MH和pAL載體的比較示意圖；

圖3是pAL的內切酶圖譜鑒定圖；

圖4是pALHB所表達的噬菌體抗體的ELLSA檢測結果。

圖5是pALHBK和pALHBHA在GS1365菌中的重組結果。

圖中數字和字母所表示的相應部件名稱：

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。

本發明提高了一種抗體表達載體的構建方法，在將表達載體p3MH改造為PAL過程中，使用兩種DNA操作，包括以下步驟：

(1)表達載體的構建；

(2)噬菌體的制備和滴定；

(3)抗體基因的細胞內重組；

(4)酶聯免疫吸附劑測定。