[發(fā)明專利]雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒、制備方法及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310340100.4
• 申請日: 2013-08-06
• 公開（公告）號: CN103513032A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發(fā)明（設計）人: 李富祥;李華春;廖德芳
• 申請（專利權）人: 云南省畜牧獸醫(yī)科學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

技術領域

本發(fā)明專利涉及一種雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒、制備方法及應用，鼻氣管鳥桿菌YN12091（Ornithobacterium?rhinotracheale?YN12091，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位地址：中國?武漢?武漢大學；保藏日期2013年7月6日；菌株保藏號是：CCTCC?No.：M2013318，簡稱ORT），血凝抑制抗體檢測試劑盒、制備方法及應用，特別是檢測雞鼻氣管鳥桿菌血清抗體和卵黃抗體水平的半定量檢測試劑盒。?

背景技術

鼻氣管鳥桿菌（Ornithobacterium??rhinotracheale??YN12091，簡稱ORT）是新命名的一種以家禽和野禽呼吸道疾病相關的病原體，ORT感染的主要癥狀為生長遲緩、死亡率增高、產蛋減少。肺炎，胸膜炎和氣囊炎是本病的主要病理特征，該病呈世界分布，ORT可能引起原發(fā)性或繼發(fā)性感染，其死亡率通常為1%～15%，協同感染和繼發(fā)感染其它病菌時死亡率增加，在大部分嚴重感染的情況下，其死亡率高達50%，該病給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經濟損失。?

ORT感染的血清學鑒定和免疫狀況的評估均需檢測血清或卵黃中的ORT抗體。?

現有進口的鼻氣管鳥疫桿菌間接ELISA抗體檢測試劑盒只能檢測雞和火雞血清中ORT抗體，在大規(guī)模檢測和免疫狀況監(jiān)測時需要進行大批雞只進行采血，容易造成應激影響雞的生產；另外，該進口試劑盒不能檢測卵黃中的ORT抗體，且價格昂貴使其大規(guī)模應用受到一定的限制。?

發(fā)明內容

本發(fā)明目的在于克服上述現有進口ORT間接ELISA抗體檢測試劑盒不能檢測雞卵黃中ORT抗體的不足，發(fā)明一種鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒。該試劑盒不僅能對雞血清中的ORT抗體進行檢測，而且能對雞卵黃中卵黃抗體進行檢測。?

本發(fā)明解決技術問題所采用的技術方案是：雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒包含有ORT血凝抗原、醛化綿羊紅細胞和ORT標準陽性血清，其中所述ORT血凝抗原是通過篩選ORT高血凝活性菌株，培養(yǎng)、洗滌制備；所述醛化綿羊紅細胞是通過采集綿羊血液，洗滌和離心方法制備綿羊紅細胞，用戊二醛固定并?用鞣酸鞣化制備；所述ORT標準陽性血清是通過ORT菌懸液3次免疫健康雞，第3次免疫后采集血液，離心制備。?

一種雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于工藝步驟為：?

制作ORT血凝抗原：篩選ORT高血凝活性菌株，通過培養(yǎng)、洗滌制備ORT血凝抗原；?

制作醛化綿羊紅細胞：采集綿羊血液，通過洗滌和離心方法制備綿羊紅細胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制備醛化綿羊紅細胞；?

制作ORT標準陽性血清：通過ORT菌懸液三次免疫健康雞，第三次免疫后采集血液，離心制備ORT標準陽性血清；?

將上述制備的ORT血凝抗原、醛化綿羊紅細胞和ORT標準陽性血清組裝建立雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒。?

所述雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的操作步驟即血凝抑制試驗方法步驟為：?

（1）根據血凝試驗結果配制4單位抗原：?

以能引起100%血凝的ORT血凝抗原最高稀釋倍數代表1個血凝單位，4單位抗原的的配制方法如下：試劑盒提供的ORT血凝效價為1:1024，則4單位抗原的稀釋倍數應是1:256，其中1024/4=256，稀釋時，將20μL抗原加入到5?mL?PBS中即為4單位抗原。但是，該4單位抗原必須經過驗證后才可確定其實際稀釋倍數，用于血凝抑制效價的測定；?

4單位抗原的驗證方法即血凝試驗方法：取96孔V形微量反應板（為了便于以下描述96孔板中每個孔的具體位置，將96孔V形微量反應板的8行分別命名為A～H行，12列分別命名為1～12列。如：第1行的第5列孔，則表示為A5孔；第2行的第6列孔，則表示為B6孔。）；?

?A.用移液器在A1～A6孔各加入25?μL?PBS；?

B.?吸取25?μL?ORT血凝抗原加入到A1孔中，吹打3～5次充分混勻；?

C.?從A1孔中吸取25?μL混勻后的抗原液加到A2孔中，混勻后吸取25μL加入到A3孔中，依次進行系列倍比稀釋至A4孔，最后從A4孔各吸取25?μL棄之，A5和A6孔為紅細胞對照；?

D.?自右向左依次向A6～A1孔中加入25?μL?1%(v/v)醛化綿羊紅細胞懸液；?