[發明專利]雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒、制備方法及應用

有效

• 申請號: 201310340100.4
• 申請日: 2013-08-06
• 公開（公告）號: CN103513032A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 李富祥;李華春;廖德芳
• 申請（專利權）人: 云南省畜牧獸醫科學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

1.雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒，其特征在于：所述雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的雞鼻氣管鳥桿菌（Ornithobacterium?rhinotracheale?YN12091，菌株保藏號是：CCTCC?No：M2013318，簡稱ORT），該試劑盒包含有ORT血凝抗原、醛化綿羊紅細胞和ORT標準陽性血清，其中所述ORT血凝抗原是通過篩選ORT高血凝活性菌株，培養、洗滌制備；所述醛化綿羊紅細胞是通過采集綿羊血液，洗滌和離心方法制備綿羊紅細胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制備；所述ORT標準陽性血清是通過ORT菌懸液三次免疫健康雞，第3次免疫后采集血液，離心制備。

2.一種雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于工藝步驟為：

制作ORT血凝抗原：將雞鼻氣管鳥桿菌（Ornithobacterium?rhinotracheale?YN12091，菌株保藏號是：CCTCC?No：M2013318，簡稱ORT）云南分離株YN12091（菌株保藏號是：CCTCC?No：M2013318），菌種接種于營養瓊脂培養基，篩選ORT高血凝活性菌株，通過培養、洗滌制備ORT血凝抗原；

制作醛化綿羊紅細胞：采集綿羊血液，通過洗滌和離心方法制備綿羊紅細胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制備醛化綿羊紅細胞；

制作ORT標準陽性血清：通過ORT菌懸液三次免疫健康雞，第三次免疫后采集血液，離心制備ORT標準陽性血清；

將上述制備的ORT血凝抗原、醛化綿羊紅細胞和ORT標準陽性血清組裝建立雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒。

3.根據權利要求2所述的雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：所述雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的操作步驟即血凝抑制試驗方法步驟為：

（1）根據血凝試驗結果配制4單位抗原：

以能引起100%血凝的ORT血凝抗原最高稀釋倍數代表1個血凝單位，4單位抗原的的配制方法如下：試劑盒提供的ORT血凝效價為1:1024，則4單位抗原的稀釋倍數應是1:256，其中1024/4=256，稀釋時，將20μL抗原加入到5?mL?PBS中即為4單位抗原，但是，該4單位抗原必須經過驗證后才可確定其實際稀釋倍數，用于血凝抑制效價的測定；

4單位抗原的驗證方法即血凝試驗方法：取96孔V形微量反應板（為了便于以下描述96孔板中每個孔的具體位置，將96孔V形微量反應板的8行分別命名為A～H行，12列分別命名為1～12列；如：第1行的第5列孔，則表示為A5孔；第2行的第6列孔，則表示為B6孔）；

?A.用移液器在A1～A6孔各加入25?μL?PBS；

B.?吸取25?μL?ORT血凝抗原加入到A1孔中，吹打3～5次充分混勻；

C.?從A1孔中吸取25?μL混勻后的抗原液加到A2孔中，混勻后吸取25μL加入到A3孔中，依次進行系列倍比稀釋至A4孔，最后從A4孔各吸取25?μL棄之，A5和A6孔為紅細胞對照；

D.?自右向左依次向A6～A1孔中加入25?μL?1%(v/v)醛化綿羊紅細胞懸液；

E.?將反應板置于微量振蕩器上振蕩1?min，室溫20～25℃靜置60?min后觀察結果，在醛化紅細胞對照孔即A5和A6孔出現完全沉淀的情況下，其1×單位抗原孔(A2孔)的紅血球必須達到100%凝集，同時0.5×單位抗原孔（A3孔）醛化紅細胞達到50%凝集50%下沉孔底才符合要求，否則重新調配；

（2）?取96孔V形微量反應板，用移液器在A1～A11孔各加入25?μL?PBS，A12孔加入50?μL?PBS；

（3）?在A1孔加入25?μL被檢血清或1/2倍稀釋的卵黃液（取雞蛋，將蛋殼敲出1小孔暴露卵黃，用不帶針頭的注射器吸取卵黃2?mL于玻璃瓶中，再加入2mL生理鹽水，混勻即為1/2倍稀釋的卵黃液），充分混勻后吸取25?μL加至A2孔，依次類推，倍比稀釋至A10孔，最后從A10孔各吸取25?μL棄之，設A11孔為ORT抗原對照，A12孔為醛化紅細胞對照；

（4）?在第A1～A11孔各加入25?μL?4單位抗原，置微量振蕩器上160轉/分鐘震蕩1分鐘，使反應物混合均勻，室溫靜置30?min；

（5）?自右向左依次向A12～A1孔加入25?μL?1%(v/v)醛化綿羊紅細胞懸液；

（6）?將反應板置于微量振蕩器上振蕩1?min，室溫靜置60?min后觀察結果，在醛化紅細胞對照出現完全沉淀、ORT抗原對照出現完全凝集的情況下，以完全抑制醛化紅細胞凝集的血清或卵黃最大稀釋倍數判為該血清或卵黃的血凝抑制效價，當被檢血清或卵黃抗體效價大于等于16即4log2，判為ORT抗體陽性。