[發(fā)明專利]一種莧籽降血壓活性肽制備及分離純化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310339637.9
• 申請日: 2013-08-06
• 公開（公告）號: CN104342473A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周家華;常虹;熊融;陳飛平;李紅
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/16;C07K14/415;A61P9/12
• 代理公司: 北京市中實友知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11013
• 代理人: 謝小延

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種莧籽降血壓活性肽制備及分離純化方法。

背景技術(shù)

莧籽含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸以及維生素E、維生素C、類胰島素和角鯊烯等生理活性物質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、高效的多功能珍貴植物，具有很高的綜合開發(fā)利用價值。莧籽粗蛋白含量14～18%，顯著高于一般谷物。莧籽蛋白組成主要是清蛋白、球蛋白和谷蛋白三種堿溶性蛋白，不同品種的莧籽蛋白組成稍有不同，但醇溶蛋白含量都很低，約為1.6%～2.0%，谷蛋白的含量最高約為60%～73%。因此，把莧籽蛋白作為一種新的植物蛋白資源開發(fā)利用是具有一定前途的。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)天然植物蛋白質(zhì)經(jīng)體外酶解或體內(nèi)消化酶解后，能夠產(chǎn)生具有特殊生理功能的活性肽。這類肽食用安全性高，副作用小，對高血壓患者可以起到降壓作用，而對正常血壓則無降壓作用。目前來源于食物蛋白質(zhì)的生物活性肽越來越引起有識人士的重視，特別是具有降血壓活性的多肽成為生物活性肽研究的熱點之一。

本發(fā)明擬用莧籽為原料，分離純化出一種具有降血壓功效的多肽，這種從植物中提取的多肽安全性好，將會具有很好的發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種莧籽降血壓活性肽制備及分離純化方法，以莧籽為原料，優(yōu)化莧籽蛋白提取工藝、蛋白酶水解莧籽蛋白制備降血壓活性肽工藝以及通過大孔樹脂吸附、凝膠層析和半制備高效液相色譜（HPLC）等技術(shù)分離純化出高活性的降血壓活性肽，旨在為莧籽降血壓活性肽的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

（1）莧籽蛋白的制備

將莧籽粉末與質(zhì)量濃度為0.018%的NaOH溶液按重量比為1:35配制料液，恒溫振蕩搖床升溫至35℃，振蕩提取30min，將反應(yīng)后的料液用1mol/LHCl溶液調(diào)pH至等電點4.6使可溶性蛋白沉淀；之后6000r/min離心20min，棄上清液，取沉淀；將離心后的沉淀于-55℃真空冷凍干燥16h，即制得莧籽蛋白；

（2）莧籽降血壓活性肽的制備

取莧籽蛋白于燒杯中，配制成質(zhì)量濃度為4%，于90℃熱處理10min，然后取出冷卻至54.4℃，用1moL/LNaOH調(diào)節(jié)pH=8.78，加入E/S=3.5%的堿性蛋白酶諾維信，于54.4℃，160r/min水浴搖床中振蕩3h，并用1moL/LNaOH維持反應(yīng)體系的pH=8.78±0.05之間，取出在100℃，10min滅酶后迅速冷卻，在10000r/min，4℃離心20min，取上清液冷凍干燥即得粗莧籽ACE抑制肽；

（3）莧籽降血壓活性肽的分離

在3.2×100cm的層析柱中裝滿預(yù)處理好的DA201-C大孔樹脂，濕法上柱，讓其自然沉淀得高87cm，床體積(BV)700mL的樹脂固定床；將質(zhì)量濃度為10mg/ml，pH=5，體積為1BV的酶解液以6mL/min的速度流經(jīng)層析柱，吸附完成后用1BV的蒸餾水將未吸附的蛋白以及粘附在樹脂上的雜質(zhì)沖洗干凈，再將洗脫體積4BV的體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液以5mL/min的速度流經(jīng)層析柱進(jìn)行洗脫，以A280nm≤0.05時停止洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，得到莧籽ACE抑制肽；

（4）莧籽降血壓活性肽的純化

首先采用凝膠層析，將葡聚糖凝膠G25用3～5倍體積水膨脹3h，用水清洗直至上清液沒有雜質(zhì)，緩慢裝進(jìn)10×100（內(nèi)徑mm×長度cm）層析柱中，管內(nèi)不能有氣泡，否則重新裝柱；裝完柱子后垂直自然沉降一晚上，使柱床緊密均一；上樣是，先讓管內(nèi)的水位降至凝膠表層2～3mm，加入2mL質(zhì)量濃度為50mg/mL的大孔樹脂純化后的莧籽ACE抑制肽溶液，待肽溶液留至凝膠表層2～3mm時，加入3～4mL的水沖洗柱壁，連接恒流泵，用純水以0.4ml/min的流速洗脫，每5min收集一管，收集完后以同樣的流速沖洗、平衡柱子；

其次采用半制備高效液相色譜：將使用凝膠層析后收集的樣本再經(jīng)過半制備高效液相色譜純化，其液相條件:Varian?ProStar218系統(tǒng)，VarianC18（21.2*150mm）色譜柱，流速10ml/min，檢測波長220nm，進(jìn)樣量10mg/ml—1ml，柱溫25℃，洗脫條件：0～40min，乙腈質(zhì)量比為5～45%，三氟乙酸質(zhì)量比為0.1%。收集6～9min所得的組分既得莧籽降血壓活性肽。

本方法以莧籽為原料，優(yōu)化了莧籽蛋白的提取工藝，利用蛋白酶水解莧籽蛋白制備降血壓活性肽工藝，最后通過大孔樹脂吸附、凝膠層析和半制備高效液相色譜（HPLC）等技術(shù)分離純化出高活性的降血壓活性肽。這種從植物中提取的多肽安全性好，將會具有很好的發(fā)展前景。

本發(fā)明所述的一種莧籽降血壓活性肽制備及分離純化方法，以莧籽為原料，優(yōu)化莧籽蛋白提取工藝、蛋白酶水解莧籽蛋白制備降血壓活性肽工藝以及通過大孔樹脂吸附、凝膠層析和半制備高效液相色譜（HPLC）等技術(shù)分離純化出高活性的降血壓活性肽，這種從植物中提取的多肽食用安全性高，副作用小，對高血壓患者可以起到降壓作用，而對正常血壓則無降壓作用。