[發明專利]一種莧籽降血壓活性肽制備及分離純化方法

在審

• 申請號: 201310339637.9
• 申請日: 2013-08-06
• 公開（公告）號: CN104342473A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 周家華;常虹;熊融;陳飛平;李紅
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/16;C07K14/415;A61P9/12
• 代理公司: 北京市中實友知識產權代理有限責任公司 11013
• 代理人: 謝小延

1.一種莧籽降血壓活性肽制備及分離純化方法，其特征在于：

（1）莧籽蛋白的制備

將莧籽粉末與質量濃度為0.018%的NaOH溶液按重量比為1:35配制料液，恒溫振蕩搖床升溫至35℃，振蕩提取30min；將反應后的料液用1mol/LHCl溶液調pH至等電點4.6使可溶性蛋白沉淀；之后6000r/min離心20min，棄上清液，取沉淀；將離心后的沉淀于-55℃真空冷凍干燥16h，即制得莧籽蛋白；

（2）莧籽降血壓活性肽的制備

取莧籽蛋白于燒杯中，配制成質量濃度為4%，于90℃熱處理10min，然后取出冷卻至54.4℃，用1moL/LNaOH調節pH=8.78，加入E/S=3.5%的堿性蛋白酶諾維信，于54.4℃，160r/min水浴搖床中振蕩3h，并用1moL/LNaOH維持反應體系的pH=8.78±0.05之間，取出在100℃，10min滅酶后迅速冷卻，在10000r/min，4℃離心20min，取上清液冷凍干燥即得粗莧籽ACE抑制肽；

（3）莧籽降血壓活性肽的分離

在3.2×100cm層析柱中裝滿預處理好的DA201-C大孔樹脂，濕法上柱，讓其自然沉淀得高87cm，床體積(BV)700mL的樹脂固定床，將質量濃度為10mg/ml，pH=5，體積為1BV的酶解液以6mL/min的速度流經層析柱，吸附完成后用1BV的蒸餾水將未吸附的蛋白以及粘附在樹脂上的雜質沖洗干凈，再將洗脫體積4BV的體積分數75%的乙醇溶液以5mL/min的速度流經層析柱進行洗脫，以A280nm≤0.05時停止洗脫，旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥，得到莧籽ACE抑制肽；

（4）莧籽降血壓活性肽的純化

首先采用凝膠層析，將葡聚糖凝膠G25用3～5倍體積水膨脹3h，用水清洗直至上清液沒有雜質，緩慢裝進10×100（內徑mm×長度cm）層析柱中，管內不能有氣泡，否則重新裝柱，裝完柱子后垂直自然沉降一晚上，使柱床緊密均一；上樣是，先讓管內的水位降至凝膠表層2～3mm，加入2mL質量濃度為50mg/mL的大孔樹脂純化后的莧籽ACE抑制肽溶液，待肽溶液留至凝膠表層2～3mm時，加入3～4mL的水沖洗柱壁，連接恒流泵，用純水以0.4ml/min的流速洗脫，每5min收集一管；收集完后以同樣的流速沖洗、平衡柱子；

然后采用半制備高效液相色譜：將使用凝膠層析后收集的樣本再經過半制備高效液相色譜純化，其液相條件:Varian?ProStar218系統，VarianC18（21.2*150mm）色譜柱，流速10ml/min，檢測波長220nm，進樣量10mg/ml—1ml，柱溫25℃，洗脫條件：0～40min，乙腈質量比為5～45%，三氟乙酸質量比為0.1%。收集6～9min所得的組分既得莧籽降血壓活性肽。

2.一種莧籽降血壓活性肽，其特征在于：根據權利要求1所述的制備方法獲得。