[發明專利]改進無固定點靶物質的青霉素類抗生素適配體及其應用

有效

• 申請號: 201310338219.8
• 申請日: 2013-08-05
• 公開（公告）號: CN103387991A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 周培;賀蘭;智文婷;詹深山;羅艷芳;劉樂
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N21/31
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

技術領域

本發明涉及的是一種無固定點靶物質的青霉素類抗生素適配體篩選領域，特別涉及利用鏈霉親和素標記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，并通過SELEX技術篩選出青霉素類抗生素適配體。

背景技術

適配體(aptamer，或核酸適配體)是一小段經過SELEX技術(systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment，即指數富集配體的系統進化技術)體外篩選得到的寡核苷酸鏈。Aptamer一詞來源于拉丁文的―aptus‖，意思為配對適應。它可以折疊成明確三維結構的、通過空間構型互補與靶分子高親和性高特異性結合。1990年，Ellington和Szostak在《Nature》上首次報道了這種大容量隨機單鏈寡核苷酸文庫通過篩選、擴增的技術，篩選到能夠特異性結合于染料小分子的RNA適配體；Tuerk和Gold在《Science》上報道了篩選出了T4DNA聚合酶；Robertson和Joyce則體外篩選出了Ⅰ型核酶，這三個課題組推動了SELEX技術的快速發展。SELEX技術的基本原理就是利用分子生物學技術，首先構建一個人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫，這個文庫中的每一條隨機寡核苷酸，其隨機區的每個核苷酸位置都存在4種可能性，如果隨機區有n個核苷酸，那么隨機序列的多樣性就有n⁴種，再加上稀有堿基或人為修飾堿基，隨機序列的多樣性會更多。一般隨機區域的長度為30個核苷酸左右，庫容量便可達到10¹⁴～10¹⁵個單鏈寡核苷酸序列之間。文庫的中間為隨機序列，序列長度往往在20～40bp之間。隨機序列兩端是帶有限制性內切酶位點的固定序列，此固定序列是多聚酶鏈反應及其他酶學反應相關引物的結合位點。在隨機文庫中，單鏈隨機寡核苷酸不同分子有其獨特一級序列，易形成多種三維空間立體結構，幾乎能與自然界所有存在的種類分子作用。用它與靶物質混合,混合液中存在靶物質—核酸的復合物，洗掉未與靶物質結合的核酸，分離與靶物質結合的核酸分子,以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進行下一輪的篩選過程。通過重復的篩選與擴增，一些與靶物質不結合或與靶物質有低親和力、中親和力的DNA或RNA分子被洗去，而與靶物質高有親和力的DNA分子或RNA分子從中被分離出來，且純度隨SELEX過程的進行而增高，經數十輪后克隆測序后篩選得到適配體。

SELEX過程中的關鍵步驟是將未結合的核酸與能與靶物質結合的核酸分開。大多數研究者選擇將靶物質固定，當單鏈寡核苷酸庫與靶物質混合，能與靶物質結合的核酸分子隨著靶物質一起留在固定介質上后，洗去不能結合的核酸。通過固定靶物質的方法，人們運用SELEX技術已成功篩選到包括有機染料、藥物、氨基酸、細胞因子、輔因子、氨基糖苷、氨基類似物、核苷酸和多肽等物質的適配體，青霉素類抗生素適配體的篩選少見報道。但運用該方法的前提是靶物質有固定點，而有些靶物質由于分子量過小等原因無法進行固定，因此開發一種無固定點靶物質的青霉素類抗生素適配體的篩選方法是十分有必要的。

經過對現有技術的檢索發現，中國專利文獻號CN103114147A，公開日2013-05-22，公開了一種分析化學核酸適配體篩選技術領域的無固定點靶物質的適配體篩選方法，該技術通過構建隨機寡核苷酸文庫以及用于PCR擴增的上游引物和下游引物和固定寡核苷酸文庫引物，并利用鏈霉親和素標記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，最終通過SELEX方法篩選得到可用于克隆測序的PCR產物，經測序后得到與無固定點靶物質特異親和性結合的適配體。將該方法應用于重金屬鎘離子適配體的篩選，得到13條能與鎘離子高特異性、強親和力作用的適配體。本發明固定效果好、適用性強且成本低，可用于無固定點靶物質的適配體篩選。但該技術在洗脫與靶物質鎘離子親和力弱的核酸后，需要在固定了鎘離子的ssDNA液中加入抑制劑，以去除重金屬鎘離子，防止鎘離子對下一部PCR擴增的干擾作用。此過程可能會造成與鎘離子親和力高的ssDNA丟失或帶入其他物質。

發明內容

本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種改進無固定點靶物質的青霉素類抗生素適配體及其應用，通過固定寡核苷酸文庫，洗脫未固定的核酸，正向篩選時加入青霉素類抗生素的母核6-APA（6-氨基青霉烷酸）與固定的核酸作用，洗脫下能與6-APA結合的核酸分子后，直接PCR擴增后用于下一輪篩選；負向篩選時加入其他抗生素，洗脫除去與青霉素類抗生素非特異性結合的核酸分子。經過多輪次的正、負篩選，得到10條與6-APA高特異性、強親和力作用的核酸適配體。