[發(fā)明專利]基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的人參皂甙提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310336081.8
• 申請日: 2013-08-05
• 公開（公告）號: CN104342399A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李肖利
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州同心創(chuàng)遠(yuǎn)生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C07J17/00
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物微分子提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其是基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的人參皂甙提取方法。

背景技術(shù)

人參皂甙是人參的主要成分，可延緩神經(jīng)細(xì)胞衰老并降低老年發(fā)生的記憶損傷，具有穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)和促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的作用，可以提高記憶力。人參皂甙及單體、多糖廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥、化工等很多領(lǐng)域，隨著社會高速發(fā)展，其用量越來越大，價格成本越來越高，但傳統(tǒng)人參皂甙及多糖的提取方法是用人參的根、莖、葉、須根等植物體提取所得，這種工藝所得的產(chǎn)品已經(jīng)越來越不能滿足市場的需求。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，用細(xì)胞進(jìn)行人工培樣繁殖提取植物的次代謝產(chǎn)物，不受土地面積、氣候環(huán)境、地域、病蟲害等限制影響，適于工業(yè)化生產(chǎn)。利用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)人參皂甙及單體、多糖的技術(shù)，在國內(nèi)外早有研究，也取得了諸多成果，但在工業(yè)化生產(chǎn)推廣過程中也存在很多難題問題，如工藝復(fù)雜、條件苛刻、易污染、收率低等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服上述技術(shù)缺點提供基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的人參皂甙提取方法。

本發(fā)明解決技術(shù)問題采用的技術(shù)方案為：基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的人參皂甙提取方法，，是一種利用多年生人參的根細(xì)胞培養(yǎng)，利用酶技術(shù)縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，來生產(chǎn)人參皂甙及多糖的方法。具體步驟在下面進(jìn)行闡述。

（1）種子細(xì)胞采集：

①取新鮮的多年生人參的根清洗消毒，將洗凈的人參塊根用10-20%次氯酸鈉溶液浸泡10-30分鐘，用無菌水清洗塊根至次氯酸鈉無殘留；

②將清潔后的塊根放入打漿機加入MS（Murashige-Skoog）培養(yǎng)基，每1.5g加入10ml，打漿；

③將打漿液加入纖維素酶100mg/kg，放置3-5小時，用50-80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液用低速離心機分離，去雜質(zhì)及上清液收集種子細(xì)胞；

（2）種子細(xì)胞培養(yǎng)：

①將收集到的種子細(xì)胞接種到含改良MS培養(yǎng)基的種子罐（瓶）中，接種量為10-20（鮮種量）/L，調(diào)pH5-6，溫度20-25℃；

②搖床或震蕩種子罐培養(yǎng)20-30小時，計算細(xì)胞數(shù)量20000-40000個/ml，即可擴(kuò)大培養(yǎng)；

（3）細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)：

①將培養(yǎng)好的種子細(xì)胞接種于有機械攪拌的生物反應(yīng)器內(nèi)，懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)基用改良的MS培養(yǎng)基，接種量為15-25g（鮮種）/L，攪拌速率90-120r/min，pH5-6，通入過濾空氣，速率0.01-0.05m³/s；

②加入生長素2,4-D（2,4-dichlorophenoxy、2,4-二氯苯氧乙酸）0.5-1mg/L，果膠酶50-80mg/L，暗培養(yǎng)20-25天，細(xì)胞計數(shù)35000-50000/ml即停止培養(yǎng)；

（4）采用離心或其他方法收集人參植物細(xì)胞，即可用常規(guī)方法提取人參皂甙及多糖。

本發(fā)明中，在種子細(xì)胞收集時加入纖維素酶，能提高種子細(xì)胞收集率5%-10%，在種子細(xì)胞培養(yǎng)中，加入生長素、果膠酶能誘使組織細(xì)胞加快生長繁殖，縮短培養(yǎng)周期，約能夠減少1/4—1/6時間。

本發(fā)明所具有的有益效果是：本發(fā)明采用細(xì)胞培養(yǎng)法來培養(yǎng)和生產(chǎn)人參植物細(xì)胞，進(jìn)而提取人參皂甙和多糖，種子細(xì)胞收集時加入纖維素酶，能提高種子細(xì)胞收集率5%-10%，種子細(xì)胞培養(yǎng)中，加入生長素、果膠酶能誘使組織細(xì)胞加快生長繁殖，縮短培養(yǎng)周期，有效降低了培養(yǎng)過程的感染率，提高產(chǎn)品收率。本發(fā)明工藝簡單、穩(wěn)定，并利用了酶技術(shù)縮短了細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高收率，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實施方式

為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合實例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。

1、細(xì)胞培養(yǎng)階段：

（1）種子細(xì)胞采集：

①取新鮮的多年生人參的根清洗消毒，將洗凈的人參塊根用10%次氯酸鈉溶液浸泡30分鐘，用無菌水清洗塊根至次氯酸鈉無殘留；

②將清潔后的塊根放入打漿機加入MS培養(yǎng)基，每1.5g加入10ml，打漿；

③將打漿液加入纖維素酶100mg/kg，放置3小時，用50微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液用低速離心機分離，去雜質(zhì)及上清液收集種子細(xì)胞；

（2）種子細(xì)胞培養(yǎng)：

①將收集到的種子細(xì)胞接種到含改良MS培養(yǎng)基的種子罐（瓶）中，接種量為20g/L，調(diào)pH6，溫度25℃；

②搖床或震蕩種子罐培養(yǎng)24小時，計算細(xì)胞數(shù)量20000-40000個/ml，即可擴(kuò)大培養(yǎng)；

（3）細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)：