[發明專利]基于氧化石墨烯的表面等離激元共振DNA傳感器的制備方法

有效

• 申請號: 201310335492.5
• 申請日: 2013-08-04
• 公開（公告）號: CN103411933A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 崔小強;鄭偉濤;薛天宇
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N21/63
• 分類號: G01N21/63
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 朱世林;王壽珍

技術領域

本發明屬于表面等離激元共振傳感器單鏈DNA生物檢測技術領域，特別涉及一種氧化石墨烯的SPR生物傳感器及其制備方法。?

背景技術

DNA作為生物的基本遺傳物質，DNA的檢測在生物技術、環保、生命科學等領域都有重大應用價值。DNA傳感器的研究在國內外受到廣泛的關注。表面等離激元共振傳感器（Surface?Plasmon?Resonance,SPR）是金屬表面的等離激元波耦合照射光產生的一種共振現象，金屬薄膜表面介電常數和厚度的變化會影響SPR共振曲線的變化，從而實現金屬表面介質環境變化的傳感。具有實時、原位和免標記檢測、檢測快速、靈敏度高，檢測極限（limited?of?detection,LOD）低等特點，目前主要用于醫藥、生物、化學、食品等領域的研究應用，可免標記檢測蛋白質，DNA等物質。但是，由于傳統檢測單鏈DNA的方法是在SPR芯片表面固定探針單鏈DNA（ssDNA）分子，利用堿基序列匹配方法捕獲樣品溶液中的目標單鏈DNA，從而實現檢測目的。?

石墨烯是2004年發現并迅速發展的一種新型材料，廣泛應用于醫藥、生物、化學、電子、物理等領域。石墨烯被氧化可以形成氧化石墨烯（Graphene?Oxide,GO），表面帶有羧基、羥基等含氧官能團，可以溶于水，與ssDNA能夠由氫鍵和π-π鍵相互作用而穩定結合，結合力遠大于雙鏈DNA（dsDNA）與GO的結合力。?

與本發明最相近的用于檢測ssDNA的技術是利用SPR芯片表面固定探針ssDNA檢測法和利用熒光標記探針分子通過熒光淬滅間接檢測法。SPR芯片表面直接檢測法是在芯片金膜表面固定探針ssDNA，直接檢測堿基匹配的ssDNA；熒光淬滅法是在ssDNA一端利用熒光分子標記，通過測定與溶液中的GO結合后熒光淬滅程度確定ssDNA數量。?

現有檢測技術存在的主要問題是：（1）SPR芯片表面直接檢測法中表面直接固定探針ssDNA的固定量少，對單鏈DNA檢測極限不夠低。（2）熒光淬滅法利用熒光分子標記探針ssDNA分子，通過熒光分子和GO結合發生熒光淬滅現象，從而間接檢測ssDNA分子，需要復雜的熒光標記過程，需要特殊的分子生物學設備，成本高，并且無法直觀檢測ssDNA分子的濃度。?

事實上，檢測ssDNA的傳感技術的發展方向是提高靈敏度和特異性，降低檢測極限，簡化檢測過程，但是，由于傳感儀器和方法的影響，無法利用很簡單的傳感方法和傳感芯片?實現對ssDNA的超低檢測極限，難以滿足科研和實際應用中樣品中對ssDNA的檢測要求。?

發明內容

本發明的目的是提供一種基于氧化石墨烯的表面等離激元共振DNA傳感器的制備方法，要解決的技術問題是，應用GO組裝表面等離激元共振（SPR）傳感器芯片表面，基于競爭抑制分析方法，利用ssDNA功能化的金納米粒子（AuNPs-ssDNA）作為競爭反應物，高靈敏度，超低檢測極限的檢測ssDNA。?

表面等離激元共振技術是，以波長為632.8nm的激光，基于棱鏡耦合方法激發厚度為50nm金膜表面的表面等離激元共振波，當發生表面等離激元共振時，入射光能量幾乎全部被束縛在金膜表面形成SPR，接受器接收到的光強最小，形成共振峰，當金膜表面介質環境的介電常數和厚度發生變化時，共振峰的強度和位置發生變化，從而，根據研究共振峰的變化可以定量研究表面介質的變化情況。?

本發明的上述目的通過以下技術方案實現：?

一種基于氧化石墨烯的表面等離激元共振DNA傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下具體步驟：?

（1）首先將化學法制備的氧化石墨烯溶于水中，通過超聲剝離得到分散性良好的氧化石墨烯水溶液，氧化石墨烯水溶液的濃度是0.01-10mg/ml；?

（2）在表面等離激元共振傳感器芯片表面通入氧化石墨烯溶液1-16小時，然后通入去離子水，用高純氮氣吹干芯片；?

（3）將單鏈DNA功能化的金納米粒子與不同濃度（10^-14-10^-6M）的堿基匹配的目標單鏈DNA溶液雜化混合1-24小時；?

（4）按照目標單鏈DNA濃度由高到低的順序，分別將以上混合溶液通入樣品池10-60分鐘，每次通入測試樣品溶液后用pH=7.4的磷酸緩沖溶液沖洗，利用表面等離激元共振傳感器測試表面等離激元共振曲線，確定共振峰位的變化。?

（5）測試完成后，通入濃度為4M的尿素溶液0.5-6小時，然后用磷酸緩沖溶液沖洗，可以使表面等離激元共振傳感芯片重復使用。?