[發(fā)明專利]一種結(jié)核蛋白及其制備和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310335183.8
• 申請日: 2013-08-02
• 公開（公告）號: CN103360480A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 焦新安;殷月蘭;高云飛;付紅;徐正中;陳祥;潘志明;孫林
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: C07K14/35
• 分類號: C07K14/35;C12N15/31;C12N15/70;G01N33/569
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種牛分枝桿菌抗原蛋白的制備方法。

背景技術(shù)

牛結(jié)核病（Bovine?tuberculosis,BTB）主要是由牛分枝桿菌（Mycobacterium?bovis）引起的一種人畜共患的慢性傳染病，以病牛食欲下降，日漸消瘦，貧血，產(chǎn)奶減少等為特征。至今，牛結(jié)核病所造成的損失大于牛的其他各種疾病所造成損失的總和。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動物傳染病，我國將其列為二類動物疫病。每年，世界上大約有3百萬人感染牛結(jié)核桿菌造成結(jié)核病。因此，世界衛(wèi)生組織WHO就指出：“在那些還存在牛結(jié)核的國家中,人類始終受到它的威脅,除非著手消滅牛結(jié)核病,否則人類結(jié)核病的防制是不會成功的。”

目前為止，消滅牛結(jié)核的唯一方法是通過“檢疫→撲殺”措施淘汰陽性牛，因此，準(zhǔn)確而及時的診斷方法對該病的控制顯得尤為重要。目前，用于牛結(jié)核病的檢測方法，大體上可以歸為三大類：（1）細(xì)菌學(xué)檢測方法，如涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、動物試驗等；（2）免疫學(xué)檢測方法，如結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（TST）、IFN-γ釋放試驗等；（3）分子生物學(xué)檢測方法，如PCR法、基因探針技術(shù)等。其中，TST是OIE唯一推薦并被世界各國廣泛使用的牛結(jié)核病診斷方法。

當(dāng)牛感染牛分枝桿菌時，少部分的牛會形成活動性牛結(jié)核病，而大部分的牛由于自身的免疫反應(yīng)，迫使細(xì)菌進(jìn)入一種休眠狀態(tài)，從而控制疾病的進(jìn)一步發(fā)展。但是當(dāng)處于潛伏感染狀態(tài)的牛年老或者免疫能力下降時，細(xì)菌就會活化，從而發(fā)展為活動性牛結(jié)核病。而到目前為止，還沒有一種方法能夠很好的區(qū)分活動性牛結(jié)核病以及潛伏期的牛結(jié)核病。因為與活動性牛結(jié)核病相比，潛伏期的牛結(jié)核病結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（TST）與IFN-γ釋放試驗都呈陽性，但是不表現(xiàn)出其他明顯的臨床癥狀。因此傳統(tǒng)的檢測方法不能很好的檢測出處于潛伏感染狀態(tài)的牛。

根據(jù)數(shù)篇文獻(xiàn)的研究表明，DosR（Dormancy?Survival?Regulator）調(diào)控功能被認(rèn)為是牛分枝桿菌在潛伏期的存活過程中起到了至關(guān)重要的作用。它能夠控制48個基因的誘導(dǎo)活化，而這些基因是牛分枝桿菌在面對低氧、CO、NO等條件時，在體內(nèi)適應(yīng)并持留所必須的，BCG_2653c就是DosR調(diào)控編碼的潛伏期抗原。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)表明，DosR調(diào)控編碼的潛伏期抗原能夠誘導(dǎo)潛伏期感染的患者產(chǎn)生比活動性結(jié)核病患者更強的特異性免疫應(yīng)答，但是RD1區(qū)相關(guān)抗原則不明顯。因此我們推論，BCG_2653c能夠較好的區(qū)分活動性牛結(jié)核病以及潛伏期的牛結(jié)核病。

目前，國內(nèi)尚未見到有關(guān)牛分枝桿菌BCG_2653c蛋白的研究及應(yīng)用的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供克隆和表達(dá)牛分枝桿菌BCG_2653c蛋白的方法，以期能夠提供一種較好的區(qū)分活動性牛結(jié)核病以及潛伏期的牛結(jié)核病的檢測抗原蛋白。

一種針對牛結(jié)核病具有免疫原性的重組蛋白，為含有分枝桿菌BCG_2653c的蛋白。所述的的BCG_2653c的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1。其編碼的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2。

本發(fā)明制備含有分枝桿菌BCG_2653c的重組蛋白的方法是：

從BCG的基因組中擴(kuò)增出BCG_2653c片段，將膠回收后得到的BCG_2653c片段與pMD-20T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR與雙酶切驗證正確的陽性克隆測序；將測序正確的陽性克隆進(jìn)行提取質(zhì)粒，進(jìn)而雙酶切，回收目的片段，再與表達(dá)載體pET-30a連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR與雙酶切驗證正確，將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DE3感受態(tài)細(xì)胞，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到包涵體蛋白，經(jīng)蛋白變復(fù)性后，得到有活性的BCG_2653c蛋白。

本發(fā)明的重組蛋白可用于牛結(jié)核病檢測試劑。

附圖說明

圖1是BCG_2653c的PCR擴(kuò)增圖；M.DL2000Marker，1.PCR產(chǎn)物BCG_2653c。

圖2是pMD-20T-BCG_2653c的Kpn?I與Hind?III雙酶切電泳圖；M.DL2000Marker

1.PCR產(chǎn)物BCG_2653c，2.pMD20-T-BCG_2653c雙酶切產(chǎn)物，m.λ-EcoT14Marker。

圖3pET-30a-BCG_2653c雙酶切結(jié)果；

M.λ-EcoT14Marker，1.pET-30a-BCG_2653c雙酶切產(chǎn)物。

圖4BCG_2653c蛋白SDS-PAGE分析；