[發(fā)明專利]快速檢測(cè)氟羅沙星的免疫層析試紙及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310334327.8
• 申請(qǐng)日: 2013-08-03
• 公開（公告）號(hào): CN103439504A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡驍飛;張改平;鄧瑞廣;楊艷艷;柴書軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/531;G01N33/532
• 代理公司: 鄭州金成知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 41121
• 代理人: 郭增欣

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種快速檢測(cè)氟羅沙星殘留的免疫膠體金免疫層析試紙及其制備方法。?

背景技術(shù)

氟羅沙星（Fleroxacin，F(xiàn)LE），其化學(xué)名為6,8-二氟-1-（2-氟乙基）1,4-二氫-7-（4-甲基-1-哌嗪基）-4-氧-3-喹啉羧酸，分子式為C₁₇H₁₈F₃N₃O₃，分子量為369.34，為廣譜類抗菌藥物，特別是對(duì)革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的抗菌活性，具有用量少，抗菌效果好等優(yōu)點(diǎn)。但其對(duì)人體有一定的毒副作用，主要包括胃腸道反應(yīng)、肝腎毒性以及肌肉骨骼等副作用。我國(guó)農(nóng)業(yè)部制定的《2013年度動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃》中明確規(guī)定了氟喹諾酮類藥物的殘留監(jiān)控指標(biāo)以及最大殘留限量。盡管我國(guó)獸藥殘留限量參照國(guó)際和發(fā)達(dá)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定，并且獸藥使用都有休藥期規(guī)定，但從根本上解決動(dòng)物性食品獸藥殘留超標(biāo)問題仍存在較大難度。因此急需建立快速、靈敏、有效的氟羅沙星殘留檢測(cè)方法。?

目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)氟羅沙星殘留的方法主要采用理化分析方法，包括高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法（LC/MS）、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法（GC/MS）等，這些方法檢測(cè)非常有效、準(zhǔn)確和敏感，但也存在一定的缺陷，如待檢測(cè)樣品預(yù)處理過程復(fù)雜，繁瑣費(fèi)時(shí)；需要昂貴的儀器設(shè)備，推廣使用受到一定限制；對(duì)專業(yè)人員素質(zhì)要求高；儀器保養(yǎng)要求高，保養(yǎng)的好壞直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性；檢測(cè)費(fèi)用高，無(wú)法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大規(guī)模批量檢測(cè)，時(shí)效性較差。?

免疫學(xué)檢測(cè)法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待測(cè)物的初步信息，該法靈敏度較高，精確性好，分析過程相對(duì)簡(jiǎn)單，用作氟羅沙星篩查有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是需要優(yōu)先發(fā)展的檢測(cè)技術(shù)，急待研究解決。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題：提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)快速的用于檢測(cè)氟羅沙星殘留的免疫層析試紙及其制備方法。?

本發(fā)明的技術(shù)方案：?

一種快速檢測(cè)氟羅沙星的免疫層析試紙，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上設(shè)有偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白印制的檢測(cè)印跡和用羊抗小鼠IgG抗體印制的對(duì)照印跡；所述金標(biāo)抗體纖維層中的金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗氟羅沙星單克隆抗體。

所述偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白是通過以下方法得到的：?

將5.3?mg?氟羅沙星、3.1?mg?DCC和1.7?mg?NHS先后溶于1.0?mL?DMF溶液中，室溫避光攪拌4?h，充分反應(yīng)后得到A液；稱取9.5?mg?BSA溶于2?mL?PBS緩沖液中，得到B液；在室溫磁力攪拌下，將A液逐滴加入B液中，4℃反應(yīng)9?h后用PBS透析3天，換液3次/天，透析完成后，4000rpm離心5min，取上清液，得到偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白，貯藏于-20℃，備用。

所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。?

所述吸附纖維層用聚偏二氟乙烯膜、尼龍膜、玻璃纖維棉或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙制成，支撐層用不吸水的韌性材料制成；金標(biāo)抗體纖維層用吸附氟羅沙星的金標(biāo)抗體玻璃纖維棉制成。?

所述?偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。?

所述檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為平行排列的“︱︱”直線式印跡、“十十”字型排列印跡、“┬?┬”字型排列印跡、“┴?┴”字型排列印跡、“├├”字型排列印跡或“┤┤”字型排列印跡。?

在吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層和吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上偏向吸附纖維層一側(cè)0.3-0.6cm處印制有樣品標(biāo)記線。?

所述快速檢測(cè)氟羅沙星免疫層析試紙的制備方法，包括以下步驟：?

（1）氟羅沙星載體蛋白偶聯(lián)物的制備

將5.3?mg?氟羅沙星、3.1?mg?DCC和1.7?mg?NHS先后溶于1.0?mL?DMF溶液中，室溫避光攪拌4?h，充分反應(yīng)后得到A液；稱取9.5?mg?BSA溶于2?mL?PBS緩沖液中，得到B液；室溫磁力攪拌下將A液逐滴加入B液中，4℃反應(yīng)9?h，用PBS透析3天，換液3次/天，透析完成后，4000rpm離心5min，取上清液，得到偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白，貯藏于-20℃，備用；

（2）抗氟羅沙星單克隆抗體的制備；

（3）氟羅沙星金標(biāo)抗體的制備；